微小隐拘于虫（pSporndum pMum，Cp）子抱于表面蛋白 CP15、CP15／60和CP23是微小隐抱子虫主要的表面抗原，它们既是人们研究隐抱于虫新型疫苗的主要对象，也是建立隐抱子虫血清学检测方法的首选抗原。本研究应用DNA重组技术将3个基因分别克隆入原核和真核表达载体并表达，利用原核表达的融合蛋白为包被抗原建立了检测隐抱于虫的间接ELISA方法，用真核表达载体免疫动物，诱导产生了特异性免疫应答，并具有一定的保护作用。 保护性抗原基因的克隆和序列分析 根据国外发表的序列设计3对引物，从微小隐抱子虫基因组DNA中扩增出编码3个保护性抗原基因的DNA片段，分别插入到pMD18一T载体中，构建成3个重组质粒：pMD18囱T一15气pMD18 一T一15／60和pMD18 一T一23，转化克隆后进行核着酸序列测定，并用DNASIS、PROSIS软件对序列进行分析。结果为，CP15、CP15／60和 CP23的基因长度分别为 413。456和 346hp，与国外发表序列相比，核着酸和氨基酸的同源性分别为99．2o、98．9O、97．3O81 11O、99．3O、98．2O。氨基酸的变异均没导致抗原表位的变化。 原核表达载体的构建及表达 将3个基因片段克隆到pET－28of＋）载体上构建成3个原核表达载体：pET－28a－15、pET－28al5／60和pET－28a－23，经酶切鉴定后在宿主菌BLZI（DE3）中表达。结果在lmmoll IPTG诱导4h后，3个载体均得到高效表达，产物以包涵体形式存在于胞浆中，其表达量分别占菌体蛋白总量的 38％、42％和 36％。免疫印迹表明所表达的蛋白是微小隐抱子虫所特异的。 以原核表达产物为抗原的间接ELISA检测方法的建立 以在ECOli中高效表达的融合蛋白为包被抗原，以辣根过氧化物酶（HR）标记的羊抗鼠队为二抗，建立了检测微小隐泡子虫抗体的间接 ELISA方法。最佳反应条件为：0．5 u g／孔纯化的 Ecoli表达的CP重组蛋白包被酶标板（CP15伍o和CP刀的包被量为1．oVg／孔），用m％兔血清进行封闭，以正常ECOli裂解上清液稀释待检血清。结果表明应用重组抗原蛋白作为诊断微小隐泡子虫包被抗原具有特异性高，抗原易纯化，成本低等特点。 真核表达载体的构建及表达 将3个基因分别克隆到pCR3．l（＋）、pcDNA3N和 pCR3．l（十冲，构建成真核表达载体：pCR3．l－15、pCDNA3－15／60和 pCR3二一23。该重组质粒转染 Hela细胞后，经 G4 18加压筛选，得到稳定表达的细胞株。在 3种质粒转染的细胞中用间接免疫荧光方法检测到特异蛋白。 核酸疫苗接种小鼠诱导的免疫反应 应用真核表达质粒在不同的条件下免疫BALB／c ，J’鼠，在国内首次对其诱导的系统免疫和粘膜免疫的动态变化进行检测，结果为3种重组质粒免疫鼠的E一玫瑰花环形成率、特异性淋巴细胞转化值、CD厂地Ds”比率。CTL活性和特异性抗体滴度等免疫指标及血清中细胞团于 IFN－Y、IL－2和 NO均随着兔疫次数的增加，呈现逐步升高趋势，3种质粒免疫鼠之间差异不显著（p＞0，05），与对照组相比差异显著（p＜0．05），并且发现核酸疫苗免疫母鼠产生的母源抗体对仔鼠具有一定的保护作用。 核酸疫苗对山羊的免疫保护作用 分别将 pCR3．1－23单一质粒和 3种质粒的混合物经鼻粘膜接种妊娠山羊，并对免疫山羊的后代进行攻虫试验。结果表明核酸疫苗能够诱导母羊产生免疫反应，母羊能够将免疫保护力传给后代，试验组后代和对照组相比，攻虫后卵囊排出量和排出时间缩短，体重增长较快。