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第一部分自噬参与压力诱导的大鼠髓核细胞损伤的实验研究目的：观察自噬是否参与压力诱导的大鼠髓核细胞损伤,探讨压力诱导的髓核细胞损伤、死亡的机制。方法：从3月龄大鼠胸腰段椎间盘内提取髓核细胞培养,取第2代大鼠髓核细胞,1Mpa压力下培养Oh、12h、24h、36h、48h,使用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测压力条件下大鼠髓核细胞活力,透射电镜观察压力条件下髓核细胞超微结构的变化,实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time PCR)定量检测自噬相关基因(LC3B, Beclin-1)在压力条件下的表达情况,western blot检测压力条件下大鼠髓核细胞表达自噬相关蛋白(LC3B, Beclin-1)表达情况。结果：成功培养出大鼠髓核细胞,1MPa压力条件下培养髓核细胞,可见随着培养时间延长细胞出现衰老及死亡,透射电镜下观察到压力诱导损伤的大鼠髓核细胞内存在自噬相关结构,CCK8结果显示压力应激可以导致髓核细胞数目减少,压力应激早期(12h、24h、36h)实验组(3-MA组)髓核细胞存活数目与对照组相比明显减少,P值分别为0.049,0.021、0.002,晚期(48h)3-MA组髓核细胞存活数目与对照组相比明显增多,P值为0.039。PCR结果显示与正常状态下细胞相比,压力刺激12h、24h、36h、48h可诱导髓核细胞表达自噬相关基因(LC3B, Beclin-1)与0h相比表达均明显增多(P<0.05)。 western blot检测显示压力条件下培养大鼠髓核细胞12h、24h、36h、48h,自噬相关蛋白(LC3B, Beclin-1)与0h相比表达明显增多(P<0.05)。结论：自噬参与压力诱导的大鼠髓核细胞损伤、死亡,压力应激早期自噬可能对髓核细胞损伤起保护作用,晚期可能加速髓核细胞死亡,此结果将为压力诱导椎间盘退行性变防治提供新思路。第二部分压力诱导髓核细胞自噬与凋亡关系的实验研究目的：探讨压力诱导髓核细胞自噬与凋亡的关系。方法：从3月龄大鼠胸腰段椎间盘内提取髓核细胞培养,取第2代大鼠髓核细胞。使用Annexin-V/PI染色检测1MPa压力培养12h、24h、36h、48h后大鼠髓核细胞发生凋亡情况,使用自噬抑制剂3-MA抑制自噬观察凋亡情况。同时大鼠髓核细胞单丹黄酰尸胺(MDC)染色后使用激光共聚焦显微镜观察细胞内自噬空泡结构,流式细胞仪观察细胞内存在自噬空泡的细胞比例,使用凋亡抑制剂Z-VAD-FMK抑制凋亡,观察髓核细胞自噬情况。结果：MDC染色可观察到细胞内存在自噬空泡结构,流式细胞性检测1MPa压力培养12h、24h、36h、48h产生自噬空泡细胞比例分别为阳性细胞数分别为1.18±0.335,6.93±0.494,21.36±2.621,12.53±2.364,使用自噬抑制剂3-MA后,24h、36h、48h实验组(3-MA组)与对照组相比产生自噬空泡的髓核细胞数目明显减少,p值分别为0.004,0.002,0.003。1MPa压力条件下培养大鼠髓核细胞12h、24h、36h、48h后凋亡率分别为4.93±0.15,14.93±0.25,31.83±0.72,35.46±0.85。使用3-MA抑制自噬后,1MPa压力培养髓核细胞12h、24h、36h、48h细胞凋亡比例均明显增高,p值分别为0.006,0.019,0.007,0.021;Z-VAD-FMK抑制凋亡,1MPa压力培养髓核细胞12h、24h、36h、48h产生自噬空泡的髓核细胞比例也明显增高(P<0.05)。结论：压力应激条件下自噬与凋亡均参与髓核细胞损伤,且在压力诱导髓核细胞损伤过程中自噬与凋亡是紧密相关的,抑制自噬可以促进髓核细胞凋亡发生,抑制凋亡可促进髓核细胞自噬发生。第三部分压力诱导髓核细胞自噬机制研究目的：观察活性氧(ROS)是否参与压力诱导髓核细胞自噬,并阐明ROS诱导的髓核细胞自噬机制。方法：1MPa压力条件下培养大鼠髓核细胞12h、24h、36h、48h,加入荧光探针H2DCF-DA后激光共聚焦显微镜观察压力诱导髓核细胞损伤中产生髓核细胞内ROS水平,及使用流式细胞仪定量分析大鼠髓核细胞产生ROS细胞比例。使用自噬抑制剂3-MA抑制自噬后观察髓核细胞内ROS水平的变化情况。髓核细胞培养基中加入活性氧抑制剂NAC,1MPa压力培养12h、24h、36h、48h,观察抑制细胞产生ROS后细胞内自噬相关蛋白(LC3B, Beclin-1)表达情况。western blot检测在使用ROS抑制剂NAC情况下PI3K、AKT、pAKT等相关蛋白表达情况,并与无ROS抑制剂NAC干预情况下这些蛋白表达情况进行对比。同时加入JNK抑制剂SP600125,抑制JNK信号通路,观察JNK、pJNK蛋白表达变化情况。结果：1MPa压力条件下大鼠髓核细胞培养12h、24h、36h、48h,髓核细胞内ROS水平与对照组相比均明显增高(P<0.05),ROS抑制剂NAC可以抑制大鼠髓核细胞内ROS水平。使用自噬抑制剂3-MA抑制自噬后12h、24h、36h、48h分别实验组(3-MA组)与对照组比较髓核细胞内ROS水平均明显增高(P<0.05)。使用ROS抑制剂NAC后,细胞内自噬相关蛋白(LC3B, Beclin-1)及PI3K、AKT表达均逐渐减少(P<0.05),使用JNK抑制剂SP600125后pJNK表达明显减少。结论：ROS参与压力诱导髓核细胞自噬,自噬可以降低髓核细胞内ROS水平,从而减少ROS对髓核细胞损伤。ROS通过抑制PI3K-AKT-mTOR信号通路,活化JNK信号通路诱导髓核细胞自噬。少量的ROS可增加细胞内PI3K、AKT表达,利于细胞存活,过量ROS可能使JNK表达增多,致细胞死亡。