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本课题组已经克隆了扩展青霉碱性脂肪酶(Penicillium expansum lipase,PEL)基因,进行了全序列测定,并实现其在真核细胞毕赤酵母中的高效表达以及在酿酒酵母中的表达。为加深对该酶结构与功能关系的认识,改善其酶学性质,我们尝试用蛋白质工程方法对PEL进行改造,主要进行了如下几方面的工作: 采用重叠延伸PCR的方法获得突变基因PEL-D92P、PEL-G98A、PEL-N 148T、PEL-E113V、PEL-P163G、PEL-P163L、PEL-P163H、PEL-P163W、PEL-P163F、PEL-P163R,实现其在毕赤酵母GSll5中的表达,进行突变酶和野生型酶的某些性质比较。 1.突变体PEL-D92P-GS的最适作用温度提高5℃,热稳定性无明显变化。可能是脯氨酸的介入,降低无规则卷曲的柔性,使酶结构更加稳定,在高温条件下更适于与底物结合。 2.突变体PEL-G98A-GS对橄榄油水解能力发生急剧下降,几近为零。推测该点对维持酶的空间构象有重要作用。 3.突变体PEL-N148T-GS的比活约为野生型的115%,最适作用温度无明显改变,而热稳定性有所下降。可能是因为新引入的残基破坏了Asn与邻近的残基或是水形成氢键,从而导致了稳定性的降低。 4.突变体PEL—E113V—Gs的最适作用温度有所改善,热稳定性略有下降。推测可能是疏水性较强的氨基酸Val增加了酶分子的表面疏水性,从而提高酶分子的疏水性包装效率,同时突变对酶分子的空间构象影响较大,导致突变体稳定性的下降。 5.突变体PEK-P163G-GS、PEL-P163L-GS、PEL-P163H-GS、PEL-P163W-GS、PEL-P163F-GS、PEL-P163R-GS的表达蛋白量大大下降。