研究背景和目的结直肠癌(colorectal carcinoma, CRC)是我国最常见的恶性肿瘤之一,发病率呈逐年上升和年轻化趋势。侵袭和转移是导致结直肠癌患者死亡的主要原因。肿瘤转移是一个多步骤、多阶段的复杂过程,每一阶段都受多种基因／蛋白的调控,其中肿癌细胞运动行为的改变和运动能力的增强是其侵袭和转移所必不可少的。因此,寻找有效、特异的转移相关基因并探讨其功能,不仅有利于阐明结直肠癌转移的分子机理,还能为临床诊治、药物筛选及预后判断提供新的靶点。肿癌细胞和宿主之间的相互作用是肿瘤发生发展的内在因素,肿癌细胞转移具有一定的器官倾向性,这可能是瘤细胞与特定的器官微环境相互作用的结果。肿瘤转移取决于肿瘤细胞本身的分子特性和其分泌的因子对周围间质细胞的影响,包括血管、结缔组织和免疫细胞等。特殊的肿瘤微环境通过各种调节机制影响着肿瘤细胞的生长发展和侵袭转移。因此,肿瘤转移不只是肿瘤细胞本身的生物学特性及遗传特性所决定,从根本上说是癌细胞与宿主相互作用的结果,宿主甚至起决定性作用。造血祖细胞(hematopoietic progenitor cell,HPC)是造血组织具有自我复制和分化潜能的原始细胞。对祖细胞表面标志性抗原的初步研究发现,CD133+细胞较CD34+细胞具有更强的增殖潜能且包含有更高比例的长期培养起始细胞,在正常骨髓微环境条件下CD133+细胞可能比CD34+细胞具有更强的趋化和迁移能力,CD133+造血祖细胞可能代表了更原始的造血细胞。脐血或称脐带血,是指婴儿娩出后,残留在脐带和胎盘绒毛血管内的血液。脐血中的造血祖细胞的抗原性较弱；增殖能力强；移植相关的并发症的发生率较骨髓和外周血低,且症状轻；采集保存容易；对供者无任何伤害。因此脐血被认为是极具潜力的新的造血祖细胞来源。造血祖细胞能够通过不同的机制动员进入血液循环,在外周器官组织修复、再生及肿瘤生长等生理和病理过程中均发挥重要作用。有学者发现骨髓来源细胞对于肿瘤血管生成、淋巴管生成及肿瘤间质形成、甚或肿瘤的发生均有着密不可分的关系。又有在动物肿瘤层次的研究初步证实其在肿瘤转移的早期阶段发挥关键作用。VEGFR-1+HPC在肿瘤细胞到达特定器官前提前到达,并为肿瘤细胞的到达以及生长创造一个适宜的微环境即“转移前微生境”。该观点改变了我们对肿瘤转移的传统认识,使我们认识到肿瘤转移不仅仅是肿瘤细胞本身的作用,还包含正常的骨髓起源细胞的再生与聚集。但造血祖细胞在人实体肿瘤的主要作用及机制仍不十分清楚,目前尚未在人类肿瘤模型上得到进一步的证实。本研究重点探讨CD133+脐血造血祖细胞对低、中、高转移潜能的结直肠癌细胞HCT-116、HT-29、LOVO的体外生存、增殖、侵袭及转移能力的影响。且通过裸鼠体内原位移植实验探讨CD133+造血祖细胞对低转移潜能大肠癌细胞SW480EGFP+体内转移的影响。通过体外和裸鼠体内实验阐明CD133+造血祖细胞在不同转移潜能结直肠癌生长、侵袭和转移中的主要生物学功能,为揭示结直肠癌转移机制奠定研究基础,为大肠癌转移的早期诊断和治疗奠定理论基础。研究方法1、CD133+脐血造血祖细胞的干性维持培养及鉴定由南方医院妇产科提供新鲜脐血标本16例,在脐血采集后4h内,利用人CD133+免疫磁珠分选系统,分离出CD133+造血祖细胞,予流式细胞仪分析。采用牛血清白蛋白(BSA)和SCF、TPO、IL-3、IL-6、Flt3Ligand五种细胞因子按10:2.5:1:1:1:1的比例组合的培养基培养细胞8周后,再次予细胞形态学、流式细胞仪、免疫细胞化学染色及免疫荧光技术鉴定细胞的干性。2、CD133+脐血造血祖细胞对不同转移潜能结直肠癌细胞中MAP4K4的表达和生物学特性的影响将CD133+脐血造血祖细胞分别与低、中、高转移潜能的大肠癌细胞HCT-116、HT-29和LOVO均按1：20比例进行直接共趋化培养,通过MTT细胞体外增殖实验和平板克隆形成实验检测CD133+脐血造血祖细胞对不同转移潜能大肠癌细胞增殖能力的影响；通过细胞基质粘附实验检测CD133+脐血造血祖细胞对不同转移潜能大肠癌细胞粘附能力的影响；用划痕实验检测CD133+脐血造血祖细胞对不同转移潜能大肠癌细胞迁移愈合能力的影响；用Transwell小室法检测CD133+脐血造血祖细胞对不同转移潜能大肠癌细胞迁移和侵袭能力的影响；用荧光定量PCR实验和Western blot实验检测CD133+脐血造血祖细胞对不同转移潜能大肠癌细胞中肿瘤增殖和转移相关基因丝裂原激活蛋白激酶激酶激酶激酶4(MAP4K4)表达的影响。最后我们观察并比较CD133+造血祖细胞作用前后不同转移潜能大肠癌细胞体外增殖、侵袭和转移能力的变化。3、应用整体可视化人结肠癌转移动物模型观察共移植效应利用稳定表达绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的结肠癌细胞株SW480/EGFP+,通过皮下成瘤和原位移植方法建立人结肠癌转移动物模型。利用肿瘤细胞稳定表达EGFP的特点,应用整体可视化动物模型和病理学技术分别对单独移植和共移植组的人结肠癌转移动物模型进行评价和鉴定,从而检测CD133+脐血造血祖细胞对低转移潜能的结直肠癌细胞SW480/EGFP+成瘤及体内转移能力的影响。研究结果1、CD133+脐血造血祖细胞的干性维持培养及鉴定由南方医院妇产科提供,脐血标本共16份(其中15份成功提取新鲜细胞,1份失败),35～50ml/份,8%枸橼酸抗凝,经产妇和家属同意取自足月健康顺产新生儿,新鲜脐血采集后4h内,免疫磁珠法分离出CD133+造血祖细胞。从新鲜的脐血中得到的单个核细胞数平均为(1.82+0.15)×107/ml,经CD133磁珠分离系统分离得CD133+富集细胞的平均数为(1.66+0.01)×105/ml,新鲜脐血单个核细胞中的CD133+细胞所占比例为(0.8+0.01)%,经流式细胞仪分析,CD133+细胞纯度达到85%以上,CD133+CD34+细胞纯度达到80%以上。CD133+细胞培养8周后,再次通过细胞形态学、流式细胞仪、免疫细胞化学染色和免疫荧光鉴定细胞的干性,CD133CD34双阳性细胞数仍为80%以上。2、CD133+脐血造血祖细胞对不同转移潜能结直肠癌细胞中MAP4K4的表达和生物学特性的影响(1)MTT体外增殖实验和平板克隆形成实验结果显示CD133+脐血造血祖细胞可增强不同转移潜能的结直肠癌细胞HCT-116、HT-29和LOVO的体外增殖能力(F=79.457,P=0.000；F=225.934,P=0.000；F=167.757,P=0.000和t=-9.696,P=0.000；t=-8.890,P=0.000；t=-15.015,P=0.000)；(2)细胞基质粘附实验结果显示,CD133+脐血造血祖细胞可增加不同转移潜能的结直肠癌细胞HCT-116、HT-29和LOVO的粘附能力(t=-4.106,P=0.003；t=-5.260,P=0.001;t=-7.924,P=0.000)：(3)由划痕定性实验连续观察48h的图片可直观显示,CD133+脐血造血祖细胞可增加不同转移潜能的结直肠癌细胞HCT-116、HT-29和LOVO的迁移愈合能力；(4) Transwell小室迁移和侵袭实验结果显示,CD133+脐血造血祖细胞可增加不同转移潜能的结直肠癌细胞HCT-116、HT-29和LOVO的迁移和侵袭能力(t=-55.612,P=0.000；t=-40.975,P=0.000；t=-52.012,P=0.000和t=-9.560,P=0.000;t=-7.496,P=0.000;t=-5.878,P=0.000)：(5)荧光定量PCR实验结果显示,CD133+脐血造血祖细胞可上调不同转移潜能的结直肠癌细胞HCT-116、HT-29和LOVO中MAP4K4的基因表达水平(t=-13.085,P=0.000；t=-7.060,P=0.000；t=-21.890,P=0.000)；(6) Western blot蛋白定性实验结果显示,CD133+脐血造血祖细胞可上调不同转移潜能的结直肠癌细胞HCT-116、HT-29和LOVO中MAP4K4的蛋白表达水平。3、利用整体可视化人结肠癌转移裸鼠模型观察共移植效应转染后的结肠癌细胞SW480/EGFP+稳定、高效的表达绿色荧光蛋白,且不影响细胞增殖。采用皮下成瘤和原位移植方法建立结肠癌可视化转移动物模型。皮下成瘤实验第23天,SW480/EGFP+单独注射组裸鼠还有一个部位未成瘤,结合绘制的皮下瘤生长曲线和统计学分析结果显示,CD133+脐血造血祖细胞可增加SW480/EGFP+在免疫缺陷裸鼠的皮下成瘤能力(F=10.388,P=0.006)。原位移植实验4周后,两组均可见原位瘤的形成,但均未见有转移情况,8周后,共移植组原位成瘤率为100%,50%发生肺转脏移,75%发生肝脏转移,100%发生肠转移。而单独移植组原位成瘤率为100%,0只裸鼠发生肺脏和肝脏转移,75%发生肠转移。通过免疫组织化学技术,发现共移植组原位瘤组织中MAP4K4、MMP-2、MMP-9、Ki-67、SDF-1的表达高于单独移植组。结论1、牛血清白蛋白(BSA)和SCF、TPO、IL-3、IL-6、Flt3Ligand五种细胞因子按10：2.5：1：1：1：1的比例组合的培养基培养CD133+脐血造血祖细胞八周后,仍能维持其干性,初步证明,上述培养基是可以长期维持CD133+造血祖细胞干性的有效培养基。2、CD133+造血祖细胞可显著促进不同转移潜能人大肠癌细胞的体外增殖、粘附、迁移及侵袭能力,CD133+造血祖细胞与人低转移潜能大肠癌细胞裸鼠原位共移植具有促体内转移作用,初步证明,造血祖细胞可能对不同转移潜能人大肠癌细胞生长、侵袭和转移形成具有重要影响。3、CD133+造血祖细胞可与不同转移潜能人大肠癌细胞直接作用,能上调转移相关基因MAP4K4、MMP-2、MMP-9、SDF-1和Ki-67的表达,初步表明：CD133+造血祖细胞的促不同转移潜能人大肠癌生长、侵袭和转移作用可能与肿瘤增殖、侵袭和转移相关因子MAP4K4、MMP-2、MMP-9、SDF-1和Ki-67的表达有关。1、将人造血祖细胞与不同转移潜能结直肠癌细胞株共趋化培养,直接在人癌实验层次揭示了造血祖细胞对不同转移潜能结直肠癌细胞的作用。2、将人造血祖细胞与不同转移潜能结直肠癌细胞株共趋化培养后进行人类肿瘤动物模型共移植实验研究。初步证明,CD133+人造血祖细胞可显著促进不同转移潜能人结直肠癌细胞的增殖、转移和侵袭能力,CD133+造血祖细胞与人结直肠癌细胞裸鼠体内共移植具有促转移作用,人造血祖细胞可能对人结直肠癌细胞生长、侵袭和转移形成具有重要影响。CD133+造血祖细胞的促不同转移潜能人大肠癌生长、侵袭和转移作用可能与肿瘤增殖、侵袭和转移相关因子MAP4K4、MMP-2、MMP-9、SDF-1和Ki-67的表达有关。