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目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种尚无法治愈的神经变性疾病。过度磷酸化的微管相关蛋白tau（hyperphosphorylated tau,p-tau）形成神经纤维缠结（neurofibrillary tangles,NFTs）,与AD认知障碍的进展密切相关,成为早期诊断和疗效监测的生物标志物之一。本研究旨在体外制备重组人p-tau,并通过优化相关实验条件,从而提高p-tau制备的产量和质量,为基于p-tau的AD早期诊断和病程分析提供实验材料。方法:（1）重组人tau441和糖原合成激酶3β（glycogen synthesis kinase,GSK-3β）的表达、纯化和鉴定。体外合成人tau441和GSK-3β基因序列,分别在氨基和羧基末端引入6×His构建重组质粒。原核表达重组人tau441与GSK-3β蛋白,同时杆状病毒表达重组人GSK-3β蛋白;经过镍亲和层析纯化,二辛可宁酸（bicinchoninnic acid,BCA）蛋白测定法分析蛋白浓度,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE）考马斯亮蓝染色分析其纯度,Western blot鉴定重组蛋白的免疫反应性。（2）重组人p-tau制备和优化。在商品化GSK-3β反应体系基础上,进一步优化了酶和三磷酸腺苷（adenosine triphosphate,ATP）的反应浓度,确定反应最适的温度和p H值;比较了本研究自制GSK-3β和进口商品的活性、稳定性和产率。（3）重组人p-tau的鉴定。通过液相色谱-质谱联用仪（liquid chromatograph mass spectrometer,LCMS）和斑点印迹检测重组人tau441磷酸化位点;负染透射电镜（transmission electron microscopy,TEM）和硫磺素T（Thioflavin T,Th T）结合试验分析磷酸化产物聚集形成纤维的情况;细胞计数试剂盒（cell counting kit-8,CCK-8）分析磷酸化产物对细胞活力的改变。结果:（1）SDS-PAGE考马斯亮蓝染色表明原核表达的重组人tau441蛋白表观分子量位于64 k Da左右,纯度为87%;原核和杆状病毒表达的重组人GSK-3β蛋白表观分子量位于50 k Da左右,蛋白纯度分别为86%和81%;Western blot结果证实了以上重组蛋白的免疫反应性。（2）使用上述自制GSK-3β成功实现了tau磷酸化,优化得的磷酸化反应最适条件为:tau、GSK-3β和ATP的终浓度为1μmol/L、5μmol/L和3.2 mmol/L,温度为30℃,p H 7.0～8.0。本研究制备的GSK-3β对tau蛋白p T217位点磷酸化效果显著强于进口商品（P＜0.05）。（3）LC-MS分析提示,经过GSK-3β处理,tau蛋白有23个位点发生磷酸化修饰;斑点印迹显示,兔抗p T181血清、抗体p T217和p S404（分别具有p T181、p T217和p S404磷酸化位点识别优势）识别体外磷酸化的重组人tau441。TEM分析显示,p-tau在花生四烯酸诱导后,孵育2 d后形成了长约150 nm的短小纤维结构;孵育6 d后纤维长度约为1.2μm,观察到纤维缠结的现象;Th T结合实验显示产物p-tau在2 d时荧光信号显著增强,4 d后荧光信号增长趋于平缓;考马斯亮蓝染色和Western blot结果显示聚集处理后的p-tau相比聚集前在更高分子量的位置出现条带;随着聚集反应时间的增加,p-tau聚集程度不断增强;CCK-8结果显示,磷酸化产物p-tau毒性大于tau（P＜0.05）,并且显示量-效关系;同时,随着p-tau聚集程度的增加,其细胞毒性也逐渐增强。结论:本研究成功表达纯化了重组人GSK-3β,对tau蛋白p T217位点的催化活性明显强于进口商品;利用自制的GSK-3β,成功制备了重组人p-tau蛋白,并确认p T181、p T217和p S404位点具有磷酸化修饰;优化了tau蛋白磷酸化反应体系,制备的p-tau聚集能力和细胞毒性明显增强,为基于p-tau生物标志物的AD早期诊断基础研究提供了实验材料。