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尖孢镰孢菌(Fusarium oxysporum Schl.)是一种世界性分布的土传病原真菌,给我国及世界各国的农业生产造成了巨大的经济损失。近年来,由于瓜类栽培面积扩大,致使瓜类枯萎病发生严重。目前,对于瓜类枯萎病的防治主要采用化学防治,而培育抗病品种效果不稳定,原因之一是瓜类枯萎病种内分类复杂,许多种群之间还存在交叉侵染现象。因此,探索瓜类枯萎病菌主要专化型分化因素对明确其致病机理具有重要意义。本文以分离自黄瓜、甜瓜和西瓜枯萎病株的36株尖孢镰孢菌株为材料,采用致病性分化和遗传多样性分析相结合的方法,明确黄瓜、甜瓜和西瓜尖孢镰孢菌三种专化型菌株之间的生理分化特征；在构建真核表达载体pBC-hygro-GFP基础上,采用PEG-CaCl2介导的方法成功标记了黄瓜枯萎病菌菌株FSY0957,利用标记菌株观察尖孢镰孢菌在黄瓜、甜瓜、西瓜植株根部的侵染特性；并从FSY0957菌株基因组中克隆了几丁质合成酶V类基因FochsV的cDNA全长,对其进行生物信息学分析,应用Real-Time QPCR技术,初步揭示了Fochs V基因在三种寄主植株根表的相对表达量差异特征,主要研究内容如下：1.三种瓜类尖孢镰孢菌生理分化特性研究从辽宁省沈阳、鞍山、抚顺、新民等瓜类生产基地的黄瓜、甜瓜、西瓜上采集分离的尖孢镰孢菌中选出36株具有代表性菌株,利用传统致病性测定方法,检测尖孢镰孢菌的致病性分化。应用EF-1α和β-tubulin DNA序列分析和UP-PCR分子标记技术,探究三种瓜类枯萎菌株的遗传分化关系。结果表明：供试菌株共分为3个专化型：尖孢镰孢菌黄瓜专化型(F.oxysporum f.sp.cucumerium)、甜瓜专化型(F.oxysporum f.sp.melon)和西瓜专化型(F.oxysporum f.sp.niveum)。序列分析和UP-PCR分析将供试36个菌株划分为3个基因型,只有菌株FSY951和FSY0950在UP-PCR系统发育树中同其他菌株分开,而在DNA序列分析中被聚在类群2中。此外,基因型与菌株的致病型没有显著的关系,这表明尖孢镰孢菌的毒力组与亲缘组无相关性。2.尖孢镰孢菌绿色荧光蛋白标记研究构建尖孢镰孢菌绿色蛋白标记菌株。首先将gfp基因成功整合到带有真核表达启动子的骨架载体pBC-hygro上。成功构建真核表达载体pBC-hygro-GFP,并采用PEG-CaCl2介导的方法将GFP载体成功标记黄瓜枯萎病菌株FSY0957,观察该菌株在接种黄瓜、甜瓜、西瓜幼苗时的侵染特征,发现该菌株对黄瓜植株的定殖能力明显高于对甜瓜和西瓜寄主的定殖。本试验建立的遗传转化体系,为下一步探究枯萎病菌侵染机制,定殖植物根际研究奠定基础。3.枯萎病菌致病基因Fochs V cDN A全长的克隆及序列分析以黄瓜枯萎病尖孢镰孢菌FSY0957为材料,提取总RNA。利用RT-PCR (?)口基因调取的方法,获得FochsV基因cDNA全长。此cDNA全长序列为5589bp,包括5588bp的完整ORF,编码一个含1862个氨基酸的蛋白,该蛋白含有6个跨膜结构,无信号肽,属于膜结合蛋白。与其他真菌几丁质合成酶基因同源性比对结果表明,与尖孢镰孢菌Fochs V基因的同源性最高的是赤霉菌和木霉菌。该cDNA序列已经登录GenBank并获得登录号为KC840941。4. GYBR Green I实时荧光定量PCR检测黄瓜枯萎病菌致病基因Fochs V在不同侵染阶段的表达差异本文运用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR技术,分析前人已证明的尖孢镰孢菌致病基因Fochs V在接种黄瓜、甜瓜和西瓜幼苗6、12、18、24、36、48、72、96、120和144h时的相对表达水平。明确Fochs V基因在侵染三种寄主不同时期的差异表达。结果表明：该基因在三种寄主上都呈间歇状上调或下调表达,侵染黄瓜幼苗时的各个侵染点表达量均很高,在侵染甜瓜和西瓜幼苗时只有的2-3个时间点的表达量高于对照。该结果除再次证明了Fochs V基因参与了尖孢镰孢菌对三种瓜类寄主的侵染,同时也揭示了该基因在不同侵染时期的表达量的变化。本研究建立的实时荧光检测方法为病菌的防治研究奠定了理论基础。