论文部分内容阅读
本研究通过开展猪脑心肌炎病毒(Encephalomyocarditis virus, EMCV)病原学及血清学诊断方法的建立及应用、分离和鉴定EMCV广西分离株(GXLC株)并分析其基因组分子特征、进行猪源EMCV(GXLC株)对小鼠和仔猪的致病性试验,为进一步开展EMCV的致病机理、免疫机理及综合防控技术研究奠定了坚实基础。本研究的主要结论是：1、成功建立了EMCV的一步法RT-PCR、SYBR Green I real-time RT-PCR以及TaqMan real-time RT-PCR检测方法,这些方法均具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,为EMCV的病原学快速诊断提供了有效的技术平台。2、成功利用大肠杆菌原核表达EMCV结构蛋白VP1,以此为包被抗原,建立了检测EMCV抗体的间接ELISA方法,并应用于部分规模猪场EMCV感染的血清学调查,发现血清样品阳性率达到80.79%,猪场阳性率达到100%,广西猪群EMCV感染普遍。3、成功分离和鉴定了EMCV广西地方株(GXLC株),对其全基因组序列进行测序及同源性分析、氨基酸序列比对和遗传进化分析,并对结构蛋白VP1基因及非结构蛋白3D基因的分子特征进行了重点分析,发现GXLC株基因组序列与国内外其它EMCV分离株高度同源；所有EMCV毒株可以分为Ⅰ群和Ⅱ群2个亚群,GXLC株与国内其它分离株共同分布在Ia亚群。4、成功建立了小鼠细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS的TaqMan real-time RT-PCR检测方法,以及猪细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α、iNOS的多重TaqMan real-time RT-PCR检测方法,为定性及定量检测这些细胞因子提供了有效的技术平台。5、成功开展了猪源EMCV GXLC株的致病性试验,小鼠、仔猪感染猪源EMCV后出现明显的病毒血症、临床症状、病理变化。感染动物组织器官中IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达水平显著上调,血清中IL-1β、 TNF-α蛋白含量显著升高(仅测小鼠含量),而且细胞因子的表达高峰期与出现临床症状、病理损害、死亡高峰(仅有小鼠发生死亡)的时间密切相关,细胞因子的表达水平与病理损害的严重程度密切相关。表明,GXLC株对小鼠、仔猪均具有致病性,IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎细胞因子在EMCV致病过程中发挥重要作用。