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本研究采用琼脂扩散法，利用藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)作为指示菌。分离筛选食品中能产生拮抗物质的微生物菌株。通过调节发酵上清液的pH值排除有机酸的抑菌作用，再用60％的硫酸铵饱和浓度沉淀拮抗物质，初步确定菌株产生的拮抗物质为类细菌素(Bacteriocin—like)。
研究结果如下：
1．从未灭菌的鲜牛奶中分离筛选出48株能产生拮抗物质的菌株，其中一株产生的拮抗物质能抑制藤黄微球菌(M．luteus)、单核细胞增生李斯特菌(L．monocytogenes)、大肠杆菌(E．coli)，但不抑制金黄色葡萄球菌(S．aureus)，被命名为ZD34菌株。同时还分离出一株与ZD34菌株的培养和抑菌特征相似且抑菌活性相对较弱的菌株，被命名为ZD30菌株。这两株菌株产生的拮抗物质都能被60％的硫酸铵饱和浓度沉淀下来，确定它们产生的拮抗物质为类细菌素。经16SrDNA序列分析鉴定，确定ZD30菌株和ZD34菌株均属于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)。由于ZD34菌株产生拮抗物质的活性较大且初步研究结果表明该菌株产生的拮抗物质很可能是一种新的肠球菌素，因此选择对E．faecalisZD34菌株生长和产生拮抗物质的培养条件、拮抗物质的分离纯化和理化性质进行深入的研究。
2．对E．faecalisZD34菌株生长和产拮抗物质的发酵条件初步研究表明：E．faecalisZD34菌株在MRS、M17、CM、APT四种培养基中都能生长和产生拮抗物质，但是CM培养基最适合E．faecalisZD34菌株发酵产生拮抗物质，且55％的硫酸铵饱和浓度沉淀CM培养基的发酵上清液得到的粗提物的颜色最浅，含杂蛋白较少，有利于分离纯化试验。
选择CM培养基进行发酵培养条件优化试验，确定改良CM培养基配方为：蔗糖10.0g/L，胰蛋白胨10.0g/L，酵母浸出粉10.0g/L，K2HPO41.0g/L，NaCl2.0g/L，MgSO4·7H2O0.2g/L，Tween200.2％(v/v)，调pH7.0。最适培养条件为：接种菌龄10h、接种量2％(v/v)、34℃静止培养28h。
在改良CM培养基中按2％(v/v)的接种量接种菌龄为10h的种子发酵液，34℃静止培养作E．faecalisZD34菌株生长和产拮抗物质的动力学曲线，结果表明E．faecalis．ZD34菌株在培养26h后生长达到稳定期，同时拮抗物质的产生与细胞的生长繁殖成正对应关系，在菌株的生长稳定期可达到最大的生物活性。
3．按优化的发酵培养条件，按2％(v/v)的接种量接种菌龄为10h的EfaecalisZD34菌株种子发酵液于改良CM培养基中，34℃静止培养28h后12000rpm离心5min制备发酵上清液，用55％的硫酸铵饱和浓度沉淀拮抗物质，4℃放置过夜后12000rpm离心10min，用含20mmol/LNaCl的0.2mol/L醋酸盐缓冲液(pH5.0)洗涤沉淀，即收集到含拮抗物质的粗提液。
将含拮抗物质的粗提液上CM-52离子交换色谱柱(2.5cm×20cm)，用含0～1.0mol/LNaCl的0.2mol/L醋酸盐缓冲液(pH5.0)，每隔0.1mol/LNaCl梯度进行步进式洗脱，在含0.4mol/LNaCl的0.2mol/L醋酸盐缓冲液(pH5.0)的洗脱管中得到一个活性峰。将有最大活性的洗脱液合并，可用分子截留量为1000Da的透析袋浓缩或用80％的硫酸铵饱和浓度沉淀过夜后12000rpm离心15min，用无菌去离子水洗涤沉淀浓缩回收拮抗物质。浓缩回收的拮抗物质上SephadexG-25凝胶过滤色谱进一步纯化，用无菌去离子水洗脱，得到一个活性峰。经Tricine—SDS-PAGE电泳分析，试验结果表明拮抗物质的分子量在3000Da左右。
4．反相高效液相色谱层析(RP—HPLC)再进一步分离纯化Sephadex G-25凝胶过滤色谱层析收集的活性峰。实验在HypersilQDS2柱(C18)(4.6mm×250mm，伊力特，中国)上进行；应用流动相：A相为95％乙腈-0.1％三氟乙酸，B相为5％乙腈-0.1％三氟乙酸：40min内A相跑梯度从40％至100％；流速为1ml/min；检测波长为280nm。RP—HPLC试验结果表明拮抗物质基本上得到了纯化。拮抗物质的出峰保留时间为10.405min。收集峰尖部分，经电喷雾质谱法(ESI—MS/MS)检测分析，确定拮抗物质的分子量约为3434Da。
5．拮抗物质的理化性质试验研究结果表明，拮抗物质耐pH1～13；100℃处理10min活性基本不变，100℃处理60min仍有活性，但是有很大降低，表明该拮抗物质有很好的稳定性。拮抗物质经蛋白酶E(37℃，pH7.0)、蛋白酶K(37℃，pH7.0)和胰蛋白酶(30℃，pH7.0)处理6h后均失活，进一步确定该拮抗物质为细菌素。