【摘 要】
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烟草普通花叶病是由烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)引起的,危害范围广,传播迅速,是烟草上的主要病害之一。本研究以TMV为研究对象,从饼肥和根际土壤中分离、筛选生防菌株,进行生理生化特性和分子生物学鉴定以确定其分类地位;探索发酵条件;同时进行病毒拮抗实验及基因组测序分析,以初步了解其抗病毒机理。结果如下:(1)通过一系列分离纯化与筛选,成功分离得到82株细菌菌株,
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烟草普通花叶病是由烟草普通花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)引起的,危害范围广,传播迅速,是烟草上的主要病害之一。本研究以TMV为研究对象,从饼肥和根际土壤中分离、筛选生防菌株,进行生理生化特性和分子生物学鉴定以确定其分类地位;探索发酵条件;同时进行病毒拮抗实验及基因组测序分析,以初步了解其抗病毒机理。结果如下:(1)通过一系列分离纯化与筛选,成功分离得到82株细菌菌株,利用半叶枯斑法筛选获得10株对TMV有明显拮抗作用的菌株,其中BV1的枯斑抑制率达到93.22%;后续对BV1进行形态学鉴定、生理生化鉴定与16s DNA测序比对,结果表明BV1菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。(2)采用单因素实验优化BV1发酵条件,发现BV1菌株对TMV拮抗活性最佳的发酵条件为LB培养基,p H 7.0左右,最适接种量2.5%,最佳发酵温度30℃,转速220r/min,最佳发酵时间54h。(3)利用田间小区实验验证BV1生物防治效果,人工接种TMV,空白对照区的病情指数为40.03,BV1发酵液处理区病情指数为17.90,BV1发酵液的相对防效达55.28%。(4)通过半叶枯斑法进行BV1发酵液对TMV的预防和治疗效果实验,发现其预防效果为71.43%,治疗效果为59.87%;BV1发酵液与TMV-GFP混合后接种烟草,荧光表达量远远低于对照组,表明BV1对TMV有钝化作用;实时荧光定量PCR实验发现BV1发酵液处理后的烟株PR基因的相对表达量远远高于对照组,而TMV的相对累积量远远低于对照组,表明BV1可诱导烟株产生系统抗性,抑制TMV的侵染和增殖。(5)对BV1菌株进行基因组测序与分析发现,BV1菌株与贝莱斯芽孢杆菌SCGB_1和贝莱斯芽孢杆菌SCDB_291在一个分枝上,是同一个物种,亲缘关系非常近。BV1基因组合成次生代谢产物基因簇有12个,除含杆菌素、表面活性素、丰原素和大环内酯等抗菌物质相关基因簇外,BV1中存在1种肽类天然产物III型羊毛硫肽,可能与抗病毒有关。
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