论文部分内容阅读
皮肤老化包括自然老化和光辐射老化两种形式，皮肤光辐射老化中紫外线是最重要的危险因素。慢性累积的紫外线辐射后，可直接或间接地激活老化相关的分子信号通路，从而抑制胶原及透明质酸的合成最终引起皮肤老化、皱纹形成等相关改变。多项报道从多方面已证实自然老化与光老化存在着共同的分子调控通路，因而可应用紫外线照射模拟皮肤老化建立光老化模型。皮肤老化时最重要的表现为皮肤皱纹的形成，皱纹形成的最主要原因是皮肤真皮层的胶原蛋白与透明质酸合成量的减少，而在这个过程中成纤维细胞是最重要的细胞成分。它作为真皮内的细胞外基质支架的主要生产者，参与许多动态过程并与其它细胞相互作用调控各个细胞进程的动态平衡，然而针对皮肤光老化时透明质酸的合成调控机制有待更深一层的研究。目前的研究成果表明PcG蛋白复合体是基因表观调控中一组特殊转录抑制子，它通过对染色质修饰来对靶基因发挥作用，并且参与了细胞老化的调控过程。但在皮肤老化的领域上尚无明确的研究报道，因而其是否是皮肤老化过程中的一个潜在的调控分子是一条全新未知的探索方向，本研究的目的在于探究在皮肤光老化过程中HSF（humanskinfibroblast，人皮肤成纤维细胞）和ESF（embryonalskin fibroblast，人胚胎皮肤成纤维细胞）中PcG蛋白对透明质酸的合成调控作用。本实验以人皮肤成纤维细胞和胚胎皮肤成纤维细胞为实验对象，采用紫外线照射模拟建立光老化模型，应用CCK8（Cell-countingkit8,细胞增殖实验）、流式细胞仪检测技术、ELISA（Enzyme-linkedimmunosorbentassay,酶联免疫吸附实验）和RT-PCR （Realtime-polymerasechainreaction,实时定量多聚酶链反应）等技术观察不同剂量紫外线照射细胞后不同时象的细胞增殖活性、细胞凋亡情况、透明质酸合成的改变以及细胞老化相关基因的表达改变，意在探究紫外线辐射致皮肤光老化的机制、PcG蛋白对光老化中透明质酸的合成调控作用及人皮肤成纤维细胞与胚胎皮肤成纤维细胞之间的差异。一、紫外线对HSF及ESF细胞增殖活性的影响：应用ZF-1三用紫外分析仪，选择365nm波长，应用紫外线辐照计实时检测紫外辐照度，选择0,1,2,4,8J/cm2共五个照射剂量照射细胞，并于照射后0,12h,24h三个时间点使用CCK-8试剂盒分别检测照射后的HSF及ESF的细胞增殖活性，结果显示除小剂量紫外线可促进HSF细胞增殖外，不同剂量的紫外线照射均抑制HSF及ESF细胞的细胞增殖，且剂量越大，抑制作用越明显。同时，紫外线对ESF细胞的损伤作用较HSF更强，但随时间的增加ESF表现出较HSF更强的损伤修复能力。结果具有统计学差异（P<0.05）。二、紫外线对HSF及ESF细胞凋亡的影响：应用ZF-1三用紫外分析仪，选择365nm波长，应用紫外线辐照计实时检测紫外辐照度，选择0,1,4,8J/cm2共四个照射剂量照射细胞，并于照射后0h,12h,24h三个时间点使用流式细胞仪检测照射后的HSF及ESF的细胞凋亡情况，结果显示HSF在中剂量紫外线照射时细胞凋亡比例增加，在大剂量紫外线照射时细胞凋亡比例及死亡细胞比例均减少；ESF在大剂量紫照射时凋亡细胞比例及死亡细胞比例均增加。结果具有统计学差异（P<0.05）。三、紫外线对HSF及ESF的透明质酸合成的影响：1、采取与流式检测时相同的照射条件和剂量分组，于照射后12h、24h两个时间点应用ELISA法测定HA的含量。结果显示除小剂量紫外线可促进ESF中HA的合成分泌外，不同剂量紫外线照射均抑制ESF及HSF中HA的合成。2、同样的照射条件和剂量分组，于照射后12h应用实时定量PCR技术检测照射后的HSF及ESF细胞内的三种透明质酸合成酶（HAS1、HAS2、HAS3）及透明质酸分解酶（HYAL1、HYAL2）的mRNA表达，结果发现HSF的HAS2、HAS3、HAYL1基因在不同剂量照射组中表达均上调，HAS1基因在各个剂量中表达均下调，HYAL2基因在小剂量及中剂量组表达上调，而大剂量组表达下调。ESF的HAS2、HAS3基因在不同剂量照射组中表达均下调，HAYL1基因在不同剂量照射组中表达均上调，HYAL2基因在小剂量表达上调，而在中剂量组及大剂量组中表达下调。结果具有统计学差异（P<0.05）。四、紫外线照射时HSF及ESF中PcG蛋白基因表达的变化：采取相同的照射条件和剂量分组，于照射后12h对两种细胞的PcG蛋白基因进行实时定量PCR检测，检测照射后的HSF及ESF细胞内的PcG蛋白的mRNA表达，结果发现HSF的PcG蛋白基因在中剂量紫外线照射下表达均下调，在大剂量紫外线照射下表达均上调。ESF的PCG蛋白基因在不同剂量紫外线照射下表达均下调。结果具有统计学意义差异（P<0.05）。这些结果提示紫外线辐射皮肤光老化过程中PcG蛋白可能参与了透明质酸合成的调控，且在人皮肤成纤维细胞及人胚胎成纤维细胞中的调控作用存在差异。这些实验结果为研究皮肤光老化机制提供了重要线索和新的探索方向，但其具体的调控机制有待于更进一步的研究验证。