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2007年,本实验室邹永新等定位了一个X连锁精神发育迟滞致病基因CUL4B,随后对该基因的表达模式及其转录调控、亚细胞定位和在细胞增殖中的作用进行了分析。CULAB属于Cullin基因家族,该家族成员是泛素连接酶E3 (ubiquitin ligase enzymes)的重要组成部分,在蛋白的泛素化过程中发挥重要的功能。由于对CUL4B基因发挥功能的作用机制知之甚少,本研究采用差异蛋白质组学的方法分析该基因表达产物CUL4B引起的蛋白表达谱的变化,进而探索其在相关生物过程中的可能作用机制。蛋白质组学技术由于其高通量、高灵敏度、高精度的特点在生命科学研究领域中受到了越来越多的青睐。在常规技术的基础上,本研究对以二维电泳-质谱(Two-dimensional electrophoresis-Mass Spectrometer,2 DE-MS)联用的蛋白质组学部分流程进行了改进,包括样品的制备,凝胶染色相应的胶内酶解等。在此基础上,通过利用CULAB稳定低表达及过表达HEK293体系,进行CULAB差异蛋白质组学初步研究。第一部分二维电泳-质谱联用蛋白质组学部分流程优化首先,本研究对二维电泳-质谱联用蛋白质组学部分流程进行了优化,主要包括样品制备的优化和胶内酶解的改进。在这一环节中,探索的条件主要包括：洗涤液的选择,裂解缓冲液配方以及蛋白样品的纯化。本课题从以下几方面进行了比较：在PC12(大鼠嗜铬细胞瘤细胞系)可溶性总蛋白二维电泳流程中,低离子强度的缓冲液250mM山梨醇／10mM Tris-base(pH7.0-7.4)和常用的样品清洗缓冲液PBS分别洗涤收集样品；裂解缓冲液中EDTA和Tris-base的添加与否；硫脲的有无以及DTT的浓度；蛋白样品的纯化与否以及纯化的方法,分别比较了不纯化、TCA-丙酮沉淀法和2-D cleanup kit (Bio-Rad)处理的差异。结果表明,250mM山梨醇／1OmM Tris-base与PBS相比,显著地降低了样品的盐离子浓度,使电压可顺利地上升至最大设定值,保证等电聚焦的充分进行；EDTA和Tris-base的添加与否对二维电泳结果没有显著影响；样品经2M硫脲和7M尿素组合处理后的二维电泳表现优于9M尿素；DTT浓度为65mM时点在胶图上的表现优于操作手册推荐的10mM;经2-D cleanup kit (Bio-Rad)处理样品的二维电泳表现优于另外两种,但是此法与未纯化组相比会导致部分蛋白信息在胶图上的丢失。在优化二维电泳条件的同时,本研究完善了一种高效的适用于银染和考染蛋白质凝胶的胶内酶解方法。在这一环节中,通过用一维SDS-PAGE分别分离总量为30ng、50ng和100ng的BSA (Bovine Serum Albumin),采用银染显色；一维SDS-PAGE分别分离总量为1μg、3μg、5μg和10μg的BSA,考染显色。从得到的一维凝胶上,选取若干目标蛋白条带分别采用目前广泛使用的Andrej Shevchenko等(2007)提出的胶内酶解方法(以下简称为A法)和改进的胶内酶解方法(以下简称为B法)处理,用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)分析,再通过Mascot软件查询NCBIbovine数据库鉴定蛋白质。这一部分结果表明B法在匹配的肽段数、序列覆盖率和蛋白得分值等方面都显著高于A法。将B法应用于酶解PC12可溶性总蛋白,经二维电泳分离后凝胶上的点,同样获得了较好的蛋白鉴定结果。第二部分HEK293体系中CUL4B差异蛋白质组学研究通过二维电泳分别分离野生型HEK293和实验室已建立的利用RNAi技术干扰CUL4B基因表达的miRNA-CUL4B-HEK293及其对照细胞系miNeg-HEK293可溶性总蛋白,银染显色,PDQuest 2-D软件分析找出差异蛋白。将这些差异点采用B法酶解,用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS/MS)分析,再通过Mascot软件查询NCBI-Human数据库鉴定蛋白质。这一部分取得研究结果：共鉴定了33个差异蛋白,其中蛋白得分值位于95%可信区间的共有21个。同时,构建CUL4B稳定过表达细胞系pcDNA3.1A-CUL4B-HEK293及其对照细胞系pcDNA3.1A-HEK293,分别通过二维电泳分离其可溶性总蛋白,银染显色,PDQuest 2-D软件分析找出差异蛋白。酶解后,用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI-TOF/TOF MS)分析,再通过Mascot软件查询NCBI Human数据库鉴定蛋白质。这一部分取得研究结果：共鉴定了15个差异蛋白,其中蛋白得分值位于95%可信区间的共有9个。对CUL4B稳定低表达及过表达体系筛选出的一些重要蛋白做了Western blotting和免疫共沉淀等检测验证。综上所述,本研究优化了适用PC12和HEK293的二维电泳-质谱联用蛋白质组学流程；在此基础上,进一步探讨了在HEK293中CUL4B基因低表达和过表达分别可能引起的蛋白质组变化。这些研究结果为认识CUL4B基因的功能以及进一步阐明CUL4B在疾病发生中的分子机制提供了一定的线索。