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从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中获得一条编码(Th.modifie.ofmdg4)Mod(mdg4)蛋白的cDNA序列,命名为BmMOD。该序列在GenBank的登录号为:DN237077,其ORF为108.bp,编码359个氨基酸。对该推测的序列进行同源性(blastp)比对,发现该蛋白具有两个保守的结构域:位于N端的BTB保守结构域和位于C端的FLYWCH保守结构域。与黑腹果蝇、赤拟谷盗、冈比亚按蚊以及埃及伊蚊的氨基酸同源性只有不到40%。通过SignalP3.0分析发现该蛋白N末端不存在信号肽。
利用PCR扩增目的基因完整的ORF,经过BamHI和HindIII双酶切,将该基因克隆到载体pET-28a(+)中,成功构建重组质粒pET-28a(+)-BmMOD。将重组质粒转入BL21并诱导表达,超声破碎之后经过SDS-PAGE鉴定发现此融合蛋白以包涵体形式存在。处理包涵体获得含有目的蛋白的溶液,通过N.Sepharos.6Fas.Flow亲合层析柱纯化融合目的蛋白His-BmMOD,再通过反相快速液相色谱(RP-FPLC)进一步纯化,质谱鉴定该蛋白的分子量为42.6kDa,与理论值相符。将纯化的融合蛋白作为抗原免疫新西兰兔制备多克隆抗血清,ELISA检测效价达到1:6400以上。为了进一步检测该蛋白在家蚕不同时期以及组织中的转录、表达情况,分别提取了家蚕不同时期及组织的总RNA与总蛋白。RT-PCR检测家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾等发育时期,以及五龄幼虫各组织中的靶mRNA的量,从四个发育阶段来看,mRNA的量是逐渐增高的,而组织中最多的是卵巢,其次是头,肠、马氏管、气门和表皮,相对来说丝腺和脂肪体中的表达量最少。通过Wester.blotting检测,发现该蛋白主要分布在卵与蛾中,以及组织的卵巢和头部中。利用抗体的免疫荧光标记对家蚕BmN细胞定位,观察到荧光集中分布在细胞内一个近似圆形的区域,以DAPI复染后确定为细胞核,从而证实BmMOD定位在细胞核中。