卵巢是母猪的主要繁殖器官之一,也是卵泡生长发育和排卵的场所。哺乳动物卵泡的发育是一个复杂而连续的生理过程,主要包括原始卵泡的募集、腔前卵泡的发育、有腔卵泡的选择生长以及其成熟和闭锁,其中颗粒细胞对卵泡的发育及闭锁都有着至关重要的作用。STAT3(The signal transducer and activator of transcription 3)为信号转导与转录激活因子蛋白家族的成员之一,在细胞增殖、分化以及凋亡等方面都发挥着重要作用。研究表明,STAT3基因在卵巢中表达并参与了卵泡的生长发育以及闭锁过程。本实验通过PCR扩增获得STAT3基因5’调控区序列,构建含有5’调控区序列缺失片段的双荧光素酶报告基因重组体,转染至母猪卵巢颗粒细胞,分析启动子活性并确定启动子区的核心调控区域。通过生物信息学网站预测分析并找到STAT3基因启动子核心调控区域潜在的转录因子C/EBPβ结合位点,再通过染色质免疫共沉淀(ChIP)以及结合位点突变实验验证转录因子C/EBPβ与STAT3核心调控区的结合。构建转录因子C/EBPβ超表达载体以及小干扰RNA转染到猪卵巢颗粒细胞,通过qRT-PCR、流式细胞术、Edu染色和Western Blot等实验技术,在基因mRNA和蛋白水平上分析C/EBPβ对STAT3基因的表达调控以及对颗粒细胞生长的影响。构建目的基因STAT3的超表达载体和小干扰RNA转染到猪卵巢颗粒细胞,通过流式细胞术和Edu染色研究STAT3在颗粒细胞凋亡和增殖方面的功能。最后通过分组共转染验证C/EBPβ对STAT3在颗粒细胞中功能的影响。主要研究结果如下:(1)PCR扩增获得STAT3基因启动子-2199/+375区域,构建启动子缺失片段重组载体,通过双荧光活性分析发现P3(-1034/+375)的活性显著低于P2(-1532/+375)和P4(-587/+375),确定-1532/-1034片段可能存在正向调控元件的结合位点。(2)通过TFBIND、JASPAR、Bimas等一些生物信息学网站预测-1532/-1034区域的转录因转录因子,ChIP以及结合位点突变实验证明C/EBPβ通过结合在STAT3启动子区的-1397/-1387区域。(3)构建转录因子C/EBPβ表达载体,转染至猪卵巢颗粒细胞,结果表明转录因子C/EBPβ促进STAT3基因核心调控区的转录、mRNA的生成以及蛋白合成;干扰C/EBPβ抑制STAT3基因核心调控区转录活性和mRNA的生成以及蛋白合成,表明转录因子C/EBPβ促进STAT3基因转录。(4)构建目的基因STAT3表达载体,通过流式细胞检测和Edu染色实验发现STAT3和C/EBPβ能抑制猪卵巢颗粒细胞的凋亡,促进细胞增殖,且C/EBPβ能增强STAT3在卵巢颗粒细胞中的抗凋亡和促增殖作用。综合以上结果,本研究的主要结论是C/EBPβ结合在STAT3基因启动子-1397/-1387区域并促进其转录和翻译,且能增强STAT3在猪卵巢颗粒细胞中的抗凋亡和促增殖作用。