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第一部分 不明原因复发性流产患者早孕期母胎界面Treg和Th17细胞及相关细胞因子的变化特点目的:研究旨在评价不明原因复发性流产(Unexplained recurrent spontaneous abortion,URSA)患者和正常妊娠者母胎界面,信号转导和转录激活子3(signal transducers and activators of transcription 3,STAT3)在URSA患者中磷酸化状态的改变情况,并分析这种改变对调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)/辅助性T细胞17(T helper cell 17,Th17)平衡,及相关细胞因子的影响。方法:收集URSA患者和正常妊娠妇女早孕期的蜕膜组织,流式细胞术分析蜕膜组织中Treg细胞、Th17细胞的比例,并计数CD4~+pSTAT3~+细胞的数量,酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测蜕膜组织中IL-17A、IL-10的含量。结果:URSA患者蜕膜免疫细胞中Th17细胞比例明显高于正常妊娠组(11.57±1.17%VS 4.37±0.73%,P<0.001);URSA组Treg细胞比例低于正常妊娠组(8.45±0.94%VS 13.75±1.49%,P=0.004)。Pearson相关性分析显示,Th17和Treg细胞直接存在负性相关(r=-0.876,P<0.001)。正常妊娠组的CD4~+pSTAT3~+细胞比例显著低于URSA组(36.62±3.03%VS56.37±4.42%,P=0.018)。Pearson相关性分析显示,CD4~+pSTAT3~+细胞和Treg细胞直接存在负相关(r=-0.856,P<0.001);与Th17细胞直接存在正相关(r=0.883,P<0.001)。通过ELISA检测两种细胞因子水平,发现IL-17A在URSA组的蜕膜组织中明显高于正常妊娠组,差异有统计学意义(P<0.001),而IL-10在URSA组中水平低于正常妊娠组,差异有统计学意义(P<0.001)。Spearman相关性分析显示,蜕膜组织中IL-17A的浓度和CD4~+pSTAT3~+细胞直接存在正相关(r=0.754,P<0.001);IL-10的浓度和CD4~+pSTAT3~+细胞直接存在负相关(r=-0.717,P<0.001)。结论:本部分的研究描述了母胎界面Treg/Th17细胞对于免疫平衡调节的情况,母胎界面的CD4~+T细胞STAT3磷酸化水平异常升高,促进Th17增殖、上调IL-17A分泌,同时抑制Treg细胞的增殖和IL-10的分泌。T细胞的STAT3磷酸化水平与Th17细胞数量、IL-17A浓度呈正相关,与Treg细胞数量、IL-10浓度呈负相关。母胎界面CD4~+T细胞STAT3的活化与URSA的发生密切相关。第二部分 磷酸化STAT3影响不明原因复发性流产患者早孕期母胎界面Treg细胞的功能目的:通过研究STAT3对URSA患者蜕膜Treg细胞功能的影响,明确STAT3在URSA发病中的作用,为URSA的治疗提供新的思路。方法:收集URSA患者和正常妊娠妇女早孕期的蜕膜组织,分离出蜕膜免疫细胞,利用磁珠分选的方法分选出Treg细胞和效应T细胞(responder T cells,Tresp)。流式细胞术检测Treg细胞的增殖和抑制功能,并使用STAT3抑制剂V——Stattic改变STAT3的磷酸化情况,观察其对Treg细胞增殖及抑制功能的影响。实时定量荧光PCR(quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)检测Treg细胞中STAT3、STAT5、Foxp3的表达水平。ELISA法检测STAT3磷酸化状态对Treg细胞分泌细胞因子功能的影响。并分别用IL-6、IL-23、IL-17干预Treg细胞,观察各种促炎细胞因子对Treg细胞STAT3磷酸化状态的影响。结果:URSA患者蜕膜Treg细胞的增殖和抑制功能受损。URSA组Treg细胞的增殖率较正常妊娠组明显下降(76.36±3.99%VS 86.20±2.09%,P<0.01);URSA组Treg细胞有丝分裂数较正常妊娠组明显降低(4.64×105±7.55×10~3次VS 5.07×10~5±6.53×10~3次,P<0.001)。URSA组Treg细胞的抑制率较正常妊娠组明显降低(3.35±1.43%VS 10.15±1.37%,P<0.001)。URSA患者蜕膜Treg细胞中p STAT3~+T细胞比例较正常妊娠组明显增加(65.76±5.04%VS 42.4±4.59%,P<0.001),Stattic能够抑制URSA患者蜕膜Treg细胞STAT3的磷酸化水平,URSA+Stattic组p STAT3的比例为38.9±4.76%,明显低于URSA组(P<0.001)。抑制STAT3磷酸化能够修复URSA患者蜕膜Treg细胞的增殖功能,URSA+Stattic组Treg细胞增殖率较URSA组明显增加(88.98±3.27%VS 82.24±3.12%,P<0.01);URSA+Stattic组Treg细胞有丝分裂数较URSA组明显增加(4.72×10~5±1.51×10~3次VS 4.50×10~5±1.28×10~3,P=0.038)。抑制STAT3的磷酸化同样能够明显提高Treg细胞的抑制能力,Tresp+Treg+Stattic组Treg细胞抑制率较Tresp+Treg组(72.42±2.89%VS 59.77±3.13%,P<0.001)和Tresp+Stattic组明显增加(22.94±3.47%,P<0.001)。p STAT3通过下调STAT5、Foxp3 m RNA的表达,抑制Treg细胞的增殖,URSA组Treg细胞中STAT5、Foxp3 m RNA表达量较正常妊娠组Treg细胞明显减少(P<0.01);URSA组Treg经Stattic处理后STAT5、Foxp3 mRNA的表达较URSA组Treg细胞的m RNA表达明显增加(P<0.05)。各组中STAT3 mRNA表达量无差异。p STAT3能够影响URSA组蜕膜Treg细胞分泌TGF-β1、IL-10的功能,经ELISA检测,发现TGF-β1、IL-10在Treg+Stattic组中水平明显高于Treg组,差异有统计学意义(P<0.001)。促炎细胞因子能够促进STAT3磷酸化,与对照组(41.63±1.47%)相比,IL-6组(51.47±1.48%,P<0.001)、IL-23组(46.83±2.22%,P<0.01)的p STAT3~+Treg细胞的比例明显升高,而IL-17组(43.93±1.55%)没有明显改变(P=0.138)。结论:STAT3的过度磷酸化会损害Treg细胞的功能,在URSA发病过程中起了重要的作用,STAT3的活化抑制了蜕膜Treg细胞的增殖、抑制和细胞因子分泌能力。通过抑制STAT3的磷酸化作用,能够恢复Treg细胞的功能,重建母胎界面的免疫耐受微环境,促进妊娠的建立和维持。第三部分 醋酸泼尼松调节STAT3磷酸化影响早孕期蜕膜Treg/Th17平衡目的:本研究通过建立URSA的蜕膜免疫细胞模型,观察和检测DIC中Treg/Th17细胞比例及其相关细胞因子在接受醋酸泼尼松治疗后的改变,以深入研究醋酸泼尼松影响母胎界面Treg/Th17细胞平衡的作用机制。方法:收集正常妊娠妇女早孕期的蜕膜组织,分离出蜕膜免疫细胞,根据处理的不同将DIC分为四组:(1)对照组(Control):不加额外的药物及细胞因子,培养72 h;(2)醋酸泼尼松组(PDN):培养液中添加1μM醋酸泼尼松,培养72 h;(3)促炎细胞因子组(CTK):培养液中添加10 ng/ml IL-23,20 ng/ml IL-6和5 ng/ml TGF-β1,培养72 h;(4)醋酸泼尼松+促炎细胞因子组(PDN+CTK):培养液中添加10 ng/ml IL-23,20 ng/ml IL-6和5ng/ml TGF-β1,培养24 h,之后再在培养液中加入1μM醋酸泼尼松,培养48 h。实时定量荧光PCR(quantitative Real-Time PCR,qRT-PCR)检测各处理组中DIC的STAT3、STAT5、RORC、Foxp3 m RNA的表达水平。流式细胞术检测各组DIC中Treg、Th17和pSTAT3~+细胞占CD4~+T细胞的比例。ELISA检测DIC培养上清液中IL-10、IL-17A的含量。结果:醋酸泼尼松能增加Foxp3,STAT5的转录,抑制RORC的转录。PDN组RORC mRNA相对表达量明显低于Control组,差异有统计学意义(P=0.026)。PDN+CTK组的RORC mRNA相对表达量明显低于CTK组(P<0.01);PDN组Foxp3 mRNA相对表达量明显高于Control组,约为Control组的1.7倍,差异有统计学意义(P<0.001);PDN+CTK组的Foxp3 mRNA相对表达量约为CTK组的2.1倍;PDN组STAT5 mRNA水平明显高于Control组(P<0.01),PDN+CTK组STAT5 mRNA水平明显高于CTK组(P=0.019);四组中STAT3 mRNA水平相当,无统计学差异(P=0.278)。醋酸泼尼松能抑制炎症因子对CD4+T细胞的诱导刺激,抑制DIC向Th17细胞的分化,削弱促炎因子对DIC分化为Treg细胞的抑制作用。PDN组Th17细胞较Control组明显减少(P<0.001),PDN+CTK组较CTK组的Th17细胞明显减少(P<0.001);PDN组Treg细胞较Control组明显增加(P<0.001)。PDN+CTK组较CTK组的Treg细胞明显增加(P<0.001)。Control组的CD4~+pSTAT3~+细胞比例为57.14±5.19%,显著高于PDN组的16.6±4.25%,P<0.001;CTK组为75.36±4.27%,PDN+CTK组为35.0±6.01%,比较有统计学差异(P<0.001)。CTK组与Control组相比,CD4~+pSTAT3~+细胞比例明显升高,P<0.001。Pearson相关性分析显示,CD4~+pSTAT3~+细胞和Treg细胞直接存在负性相关(r=-0.956,P<0.001);和Th17细胞直接存在正性相关(r=0.899,P<0.001)。PDN组与Control组相比,细胞培养上清液中IL-17的浓度明显降低(P=0.045);PDN+CTK组的IL-17浓度也明显低于CTK组(P=0.045)。PDN组与Control组相比,IL-10的浓度没有统计学差异(P=0.101);PDN+CTK组与CTK组相比,IL-10浓度明显升高(P=0.017)。DIC培养上清液中IL-10的浓度和CD4+p STAT3+细胞直接存在负性相关(r=-0.850,P<0.001);IL-17A的浓度和CD4~+pSTAT3~+细胞直接存在正性相关(r=0.917,P<0.001)。结论:泼尼松能够抑制STAT3磷酸化,增加STAT5、Foxp3 mRNA表达,进而促进DIC转化为Treg细胞,抑制其转化为Th17细胞。同时泼尼松还能抑制IL-17A的合成和分泌,并在炎症状态下促进IL-10分泌,以抑制母胎界面免疫排斥反应,促进免疫耐受,重建母胎界面免疫稳态,利于胚胎种植和妊娠的建立与维持。