在绝大部分感音性耳聋的患者中，内耳毛细胞的损伤或丢失是引起该疾病的主要原因。由于哺乳动物的内耳毛细胞和支持细胞的有丝分裂一般认为终止于胚胎发育中期，出生后哺乳动物前庭和耳蜗毛细胞的再生修复能力非常有限，所以该类疾病无法依靠自身的再生与修复能力得到康复。近年来，干细胞的研究成果为耳聋的治疗带来了新的思路。内耳螺旋器感觉上皮中，是否存在着休眠的干细胞?如果存在，能否在体激活该类细胞使其重新进入细胞周期而增殖，达到修复损伤的目的?除此之外，能否通过细胞移植引入干细胞，由此取代损伤部位的细胞和修复听觉功能?目前，世界上已有多家实验室开始这方面的研究。带着这些问题，本论文首先分离和培养了内耳上皮细胞(包括毛细胞和支持细胞)，研究在特定培养条件下该类细胞是否存在重新恢复增殖和再分化的能力，是否具有干细胞特性。其次，我们在体外建立了离体耳蜗组织损伤模型，运用胰岛素、FGF-2和EGF几种营养因子观察对损伤模型的作用。最后，在上述研究的基础上，将标记的神经干细胞和内耳干细胞异体移植到听觉损伤的哺乳动物内耳，跟踪移植细胞在宿主体内的存活、分化及迁移行为。此项研究是感音性听觉损伤修复的基础研究，为今后临床治疗提供一定的实验依据和数据。研究结果显示：1．从幼年大鼠(出生后7天)的内耳分离出能自我更新，不断增殖和具有多潜能分化特性的细胞群，具备了干细胞特性。在FGF-2和EGF等营养因子作用下，此类细胞可以增殖为细胞球团，经免疫细胞化学检测细胞球团呈Nestin阳性，而且大多数细胞呈现BrdU掺入阳性。在无血清悬浮培养条件下，细胞可以传代10代以上，具备不断增殖和自我更新能力。经过诱导分化，此细胞可以分化为包括内耳毛细胞、支持细胞以及神经元和神经胶质细胞等多种细胞表型。出生后七天的大鼠内耳耳蜗和柯蒂氏器(Corti)尚未完全发育成熟。多潜能干细胞的存在意味着可以通过刺激静息的内耳干细胞恢复细胞增殖周期从而产生新的毛细胞替代损伤的细胞，同时此类干细胞也可以作为重要的细胞群为将来细胞替代疗法提供细胞源。2．本实验建立了一种新的药物损伤后听毛细胞丢失和再生性修复的哺乳动物内耳离体研究模型。通过体外组织培养出生后七天大鼠耳蜗器官，以及新霉素(1mmol／L)药物损伤和营养因子诱导作用来探讨毛细胞在损伤和修复过程中的分子机制。采用毛细胞纤毛特异性抗体phalloidin来检测和分析损伤与修复过程中的细胞形态和数量的变化。研究发现，在损伤后组织培养过程中，胰岛素、FGF-2和EGF几种营养因子的协同作用在听毛细胞损伤丢失后的修复过程中存在一定的作用。本研究为重塑毛细胞再生和恢复听觉功能提供一条重要的实验思路和方法。3．由于哺乳动物内耳听觉上皮和螺旋神经节神经元(SGNs)损伤后难以再生，致使对感音性耳聋的治疗一直进展缓慢。细胞替代疗法在治疗耳聋性疾病方面具有广阔的运用前景，是近年来听觉研究领域十分关注的热点。本实验采用大鼠胚胎神经干细胞和幼年大鼠内耳干细胞作为细胞源异体移植到成年豚鼠动物的内耳耳蜗鼓阶，跟踪移植细胞在宿主内耳的存活、分化以及和宿主的整合行为。实验发现，EGFP标记的细胞能在体外较常时间传代培养。在移植4周的模型动物，有部分移植细胞分布在听感觉上皮以及螺旋神经元区域，而且发现EGFP标记的移植细胞在宿主体内存活良好，并且具有一定的功能性区域分布和潜在的迁移行为。神经干细胞和内耳细胞的异体移植具有一定的可行性，这为今后听觉损伤的细胞移植替代疗法提供了依据。综上所述，我们得出以下结论：1．本研究发现在出生后七天的大鼠内耳基底膜和柯蒂氏器附近存在处于原始状态的细胞群。此类细胞具有增殖潜能和高度自我更新能力，能连续不断的传代数次。免疫学方法检测表明，细胞在诱导条件下可以分化为内耳的毛细胞和支持细胞，以及神经系统的神经元细胞和胶质细胞，具有多潜能分化能力，具备了干细胞特性。2．耳蜗离体组织培养作为一种新的研究毛细胞损伤和修复手段为今后研究听觉恢复提供一条新的途径。实验表明：(1)耳蜗离体培养模型具有良好的可操作性及稳定性。(2)在耳蜗柯蒂氏器底部螺旋中的内毛细胞对抗生素药物的敏感性更高，更容易受损。(3)胰岛素、FGF-2和EGF几种营养因子的协同作用对听毛细胞损伤丢失后的修复存在一定的影响。3．异体移植细胞在宿主体内成活4周以上，并且具有向功能性区域迁移的趋势和潜在的分化为内耳功能性细胞能力，为听毛细胞受损或丢失引发的听觉损伤提供良好的治疗前景。同时，受损的内耳内环境的变化对移植细胞的生存和分化具有重要作用。