肝脏介导的药物代谢和转运在药物引起的肝损伤以及药物相互作用方面起着重要作用。药物的代谢活化过程能够产生反应性中间体,这些中间体可以通过耗竭GSH引起氧化应激,或与细胞内蛋白发生共价结合,从而产生细胞毒性;药物或其代谢物若抑制胆汁酸的肝胆转运过程,导致胆汁酸在肝脏中蓄积,则可能引发胆汁淤积型肝毒性。此外,药物可以通过影响代谢酶和转运体活性,改变同服药物的体内处置过程,从而影响同服药物的药效或毒性。本论文拟以具有肝毒性的非甾体抗炎药尼美舒利（NIM）为研究对象,利用各种代谢和转运体研究模型,探索NIM基于代谢与转运的肝毒性机制,并考察代谢酶和转运体介导的NIM与临床常用药物的药物相互作用,为尼美舒利的临床合理用药和安全性评价提供重要科学依据。1.NIM代谢活化与肝细胞毒性研究NIM是一种选择性抑制环氧合酶Ⅱ的非甾体抗炎药,临床使用中有严重的肝损伤报道。已有文献指出NIM硝基还原为氨基的代谢物M2在代谢酶的催化下能发生代谢活化,产生反应性中间体,该过程被认为与NIM的肝细胞毒性有关。然而,体外肝细胞实验发现,M2在大鼠原代肝细胞中孵化24 h并不产生细胞毒性,而NIM能产生浓度依赖性的毒性,提示M2的代谢活化过程不是导致NIM肝细胞毒性的原因。因此,本研究的目的为考察NIM是否存在其它代谢活化途径,并评价这些代谢活化途径与NIM肝细胞毒性的关系。在包含NIM,NADPH和GSH的人或大鼠肝微粒体孵化体系中,共检测到两种GSH结合物。经UPLC/Triple TOF MS法鉴定,一种为氧化脱硝基的GSH结合物（NIM-OH-GSH）,另一种为硝基还原为氨基的GSH结合物（NIM-NH₂-GSH）。NIM-OH-GSH在以NIM为底物的孵化体系中的生成量要远远高于以氧化脱硝基代谢物NIM-OH为底物的孵化体系中的生成量,并且环氧化物水解酶能显著抑制NIM-OH-GSH在NIM孵化体系中的生成,提示NIM-OH-GSH主要由NIM经环氧化过程产生,而非NIM-OH直接氧化产生。酶表型实验进一步证明CYP1A2是催化NIM氧化活化产生NIM-OH-GSH的主要酶。在包含NIM、NADPH和GSH的非酶孵化体系也能够检测到NIM-NH₂-GSH,提示NIM-NH₂-GSH可由NIM还原活化过程产生。生物还原剂NADPH和GSH均可以催化NIM的还原过程。此外,NIM-NH₂-GSH在胞浆孵化体系中的生成量要远高于非酶孵化体系中的生成量,且选择性醛氧化酶（AO）抑制剂雌二醇能显著抑制NIM-NH₂-GSH的生成,提示AO也参与NIM的还原活化过程。利用高分辨质谱和核磁共振氢谱确定了NIM-NH₂-GSH的结构。推测NIM的还原活化机制如下:在还原剂的催化下,硝基能被依次还原成亚硝基、羟胺和氨基;其中,亚硝基中间体不稳定,能迅速与GSH反应,产生半缩硫醛中间体和磺酰胺中间体;后者发生重排产生NIM-NH₂-GSH。NIM在人和大鼠原代肝细胞中孵化24 h产生浓度依赖性的细胞毒性,IC50值分别为213和40μM。向肝细胞中加入非特异性CYP抑制剂1-氨基苯并三唑和AO抑制剂雌二醇分别抑制NIM的氧化和还原活化过程后,NIM的细胞毒性并未降低。此外,GSH耗竭剂丁硫氨酸（BSO）也未能增加NIM的细胞毒性。以上结果表明NIM的氧化和还原活化过程不会导致肝细胞毒性,NIM自身浓度与肝细胞毒性密切相关。2.基于转运体的NIM胆汁淤积型肝毒性机制研究除了肝细胞毒性,胆汁淤积型肝毒性也是NIM临床上肝毒性的一种重要表现形式。目前,NIM产生胆汁淤积型肝毒性的机制尚不清楚。大量文献报道药物或其代谢物抑制胆汁酸转运体的功能,可能导致胆汁淤积型肝毒性。因此,本研究考察了NIM在大鼠体内的胆汁淤积型肝毒性,并利用大鼠和人肝细胞三明治模型以及悬浮大鼠肝细胞评价了NIM及其主要代谢物对胆汁酸转运体的影响。Wistar大鼠连续5天灌胃给予100 mg/kg/day NIM后,血浆中的总胆汁酸（TBA）、碱性磷酸酶（ALP）、谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平分别增加为对照组的1.49、1.31、1.60和1.29倍。血浆中的胆酸（CA）、去氧胆酸（DCA）、鹅去氧胆酸（CDCA）和熊去氧胆酸（UDCA）水平显著升高;肝脏中CA、CDCA和甘氨鹅去氧胆酸（GCDCA）水平也显著升高。利用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）法测定了最后一次给药24 h后大鼠血浆和肝脏中NIM及其代谢物的浓度。血浆中NIM、羟基化代谢物M1、硝基还原为氨基代谢物M2和进一步乙酰化代谢物M4的浓度分别为45.4、21.0、0.037和0.180μM;肝脏中NIM、M1、M2和M4的浓度分别为17.3、23.6、1.8和13.4μM。在大鼠肝细胞三明治模型中,NIM和M1浓度依赖性地降低了d8-TCA的胆汁排泄系数（BEI）和体外胆汁清除率（Clbiliary）,并且Clbiliary的降低程度要远远大于BEI的降低,提示NIM和M1能抑制BSEP介导的d8-TCA外排进入胆汁的过程,并且对d8-TCA摄取过程的抑制要远远大于对其外排过程的抑制。进一步考察了NIM和M1分别对NTCP和OATPs介导的d8-TCA摄取进入肝细胞的抑制作用。NIM和M1抑制NTCP-介导的的d8-TCA摄取的IC50分别为21.3和25.0μM,抑制OATP-介导的的d8-TCA摄取的IC50分别为45.6和39.4μM。此外,NIM和M1还浓度依赖性地降低了CDF的BEI值,提示NIM和M1能抑制MRP2介导的CDF外排进入胆汁的过程。还原型代谢物M2和M4不抑制或仅轻微抑制上述转运体。在人肝细胞三明治模型中,也得到与大鼠肝细胞类似的结果,提示NIM和M1能抑制人的胆汁酸转运体。本研究结果表明NIM和羟基化代谢物M1能抑制胆汁酸的摄取转运体NTCP和OATPs,以及外排转运体BSEP和MRP2,导致体内胆汁酸水平出现紊乱。NIM和M1对胆汁酸转运体的抑制作用可能是NIM产生胆汁淤积型肝毒性的一种原因。3.基于转运体的NIM和对乙酰氨基酚药物相互作用研究有文献报道小鼠同时给予NIM和对乙酰氨基酚（PA）可产生协同的镇痛作用。PA临床过量使用可产生严重的肝损伤,其肝毒性被认为与CYP450介导的代谢活化过程有关。曲格列酮可通过诱导大鼠肝脏CYP3A活性增加PA的代谢活化程度,使得PA在大鼠体内的肝毒性增加。此外,PA-Glu是肝脏胆管侧外排转运体MRP2及基底侧外排转运体MRP3的底物,转运体功能的改变会影响PA和PA-Glu的肝胆转运过程。本研究的主要目的为考察NIM是否会通过改变代谢酶或转运体活性来影响PA的体内处置过程,从而影响PA的肝毒性和疗效。Wistar大鼠连续5天灌胃给予100 mg/kg/day NIM后,PA的t1/2、MRT和AUC分别降低了69%、65%和53%,而tmax和Cmax无明显改变;PA-Glu的t1/2和MRT分别降低了72%和54%,Cmax和AUC分别增加了2.59倍和0.85倍,而tmax无明显改变。NIM多次给药后,PA在大鼠0-24 h尿中的累积排泄量显著降低,而PA-Glu的累积排泄量未发生明显改变。此外,PA和PA-Glu在NIM组大鼠体内的胆汁排泄量均显著降低。单次灌胃给予100 mg/kg/day NIM,PA及PAGlu在大鼠体内的药动学参数基本不变。在对照组和NIM组大鼠肝微粒体孵化体系中,4-MU和PA的葡萄糖醛酸结合物的生成量无明显差别,提示NIM多次给药不影响大鼠肝脏的葡萄糖醛酸转移酶活性。与对照组相比,NIM组大鼠肝脏MRP2的mRNA水平降低了51%,而MRP3的mRNA水平增加了7.42倍。上述结果提示NIM对MRP2的抑制以及对MRP3的诱导,使得PA-Glu肠肝循环过程受到抑制,导致PA-Glu系统暴露量增加,而PA系统暴露量降低。NIM组大鼠0-24 h尿中与代谢活化过程相关的代谢物PA-cys和PA-NAC的累积排泄量较对照组分别降低了76%和75%,提示PA的代谢活化过程减少,从而PA在NIM组大鼠体内肝毒性降低。4.基于醛氧化酶的NIM和甲氨蝶呤药物相互作用研究近期一项研究表明青少年患者同时服用NIM和甲氨蝶呤（MTX）会显著增加肝损伤风险。MTX在体内主要由醛氧化酶（AO）催化产生7-OH MTX,后者在大鼠体内的毒性要远远大于MTX,因此推测NIM可能诱导了AO,导致毒性代谢物7-OH MTX生成量增加。Wistar大鼠连续5天灌胃给予100 mg/kg/day NIM后,MTX的Cmax和AUC分别增加了0.66和1.05倍,7-OH MTX的Cmax和AUC分别增加了3.31和5.49倍。给予MTX 4 h后,NIM组大鼠肝脏中MTX的含量较对照组降低了34%,而7-OH MTX的含量则增加了1.51倍。此外,MTX和7-OH MTX在NIM组大鼠0-24 h尿中的累积排泄量较对照组分别增加了0.80和4.19倍,7-OH MTX在0-24 h粪中的累积排泄量也增加了1.08倍。MTX在不同组大鼠0-24 h粪中的累积排泄量无明显差别,这是因为大部分MTX未经吸收而直接排入粪中。NIM能剂量依赖性的增加大鼠肝脏AO活性。与对照组相比,7-OH MTX在20、50和100 mg/kg/day剂量组大鼠肝胞浆孵化体系中的生成量分别增加了0.90、2.16和2.66倍。SGX523、JNJ-38877605和NIM在100 mg/kg/day剂量组大鼠肝胞浆孵化体系中经AO催化产生的代谢物含量较对照组也分别增加了2.36、2.84和1.69倍。RT-PCR和Western Blot结果表明大鼠肝脏AOX1和AOX3的mRNA水平无明显改变,但AOX1的蛋白表达水平呈现出剂量依赖性的增加,AOX3的蛋白表达水平呈现出剂量依赖性的降低。体外肝细胞实验也表明NIM能诱导大鼠和人肝细胞的AO活性。与对照组相比,10、20和50μM NIM使7-OH MTX在大鼠肝细胞中的生成量分别增加了0.50、1.80和3.89倍,10μM NIM使7-OH MTX在人肝细胞中的生成量增加了0.75倍。本研究证明NIM能诱导AO,导致MTX的毒性代谢物7-OH MTX生成量增加,进而可能增加MTX的肝毒性风险。5.结论本论文以具有肝毒性的非甾体抗炎药NIM为研究对象,系统研究了其基于代谢和转运的肝毒性机制和药物相互作用。NIM的肝毒性与其代谢活化过程无关,但NIM本身及其羟基化代谢物对胆汁酸转运体NTCP、OATPs、BSEP和MRP2的抑制,是导致其胆汁淤积型肝毒性的原因之一。NIM对MRP2的抑制以及对MRP3的诱导也会使临床常用药物对乙酰氨基酚主要代谢产物葡萄糖醛酸结合物的肝肠循环过程受抑制,导致原形药物的体循环含量降低,进而降低其药效。NIM也能通过诱导AO增加甲氨蝶呤毒性代谢物7-羟基甲氨蝶呤的生成,进而增加甲氨蝶呤的肝毒性风险。本论文结果提示肝脏介导的药物代谢和转运在药物引起的肝毒性以及药物相互作用方面起着重要作用。在药物的开发阶段,除了鉴定稳定代谢产物,以及考察对常规代谢酶（如CYP450酶）和转运体（如P-gp和BCRP）的抑制和诱导作用外,还应关注反应性代谢产物,以及对特殊代谢酶和转运体,如AO和MRP2,的影响,以避免药物在临床使用中出现不良反应。