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目的:研究水通道蛋白9(Aquaporin 9,AQP9)如何参与肝细胞肝癌缺氧微环境中癌细胞的缺氧应答,并初步探讨其可能的机制。方法:(第一部分)本实验采用低氧三气培养箱培养构建SMMC-7721和Huh-7细胞缺氧模型。应用qRT-PCR和蛋白质印迹法检测SMMC-7721和Huh-7细胞AQP9的mRNA和Huh-7细胞的AQP9蛋白质的表达随着缺氧时间的变化情况。应用重组慢病毒感染SMMC-7721和Huh-7细胞,构建AQP9过表达细胞株(SMMC-7721-AQP9和Huh-7-AQP9),以空载体LV-PWPI作为阴性对照(SMMC-7721-PWPI和Huh-7-PWPI),然后通过si RNA-AQP9干扰过表达AQP9细胞中的AQP9(SMMC-7721-AQP9-siAQP9和Huh-7-AQP9-si AQP9),siNC作为对照(SMMC-7721-AQP9-si NC和Huh-7-AQP9-siNC)。通过蛋白质印迹法和细胞免疫荧光激光共聚焦检测病毒转染的细胞AQP9的蛋白质的表达水平和定位。通过细胞增殖活性检测法(Cell Counting Kit-8,CCK8)和transwell法检测SMMC-7721-AQP9,Huh-7-AQP9,SMMC-7721-PWPI和Huh-7-PWPI细胞在缺氧环境中的增殖和侵袭能力。通过蛋白质印迹法检测表达增加的AQP9对磷脂酰肌醇-3-羟激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)-苏氨酸激酶(Serine-threonine kinase,AKT)-哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Mammalian target of rapamycin,MTOR)信号通路相关蛋白表达水平的影响。通过酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,Elisa)检测细胞外分泌液中人胰岛素样生长因子(Human Insulin Like Growth Factor,IGF2)的表达水平。通过qRT-PCR检测缺氧诱导因子-1(Hypoxia inducible factor-1,HIF-1α)通路相关基因的mRNA表达情况,免疫荧光激光共聚焦检测该蛋白表达的定位。(第二部分)收集25例肝癌病例,IHC法检测标本中AQP9蛋白与HIF-1α蛋白表达区域的相关性。(第三部分)通过裸鼠皮下成瘤实验,观察表达增加的AQP9对裸鼠皮下成瘤率及生长速度的影响;通过免疫组织化学法检测瘤体内HIF-1α和AQP9蛋白表达的相关性。结果:(第一部分)与常氧状态下相比,在缺氧环境中应用qRT-PCR和蛋白质印迹法检测Huh-7细胞的AQP9 mRNA(F=435.693,P=0.00)和蛋白水平(F=586.788,P=0.00)的表达明显降低(P<0.05),SMMC-7721细胞中AQP9的mRNA水平(F=708.757,P=0.00)明显降低(P<0.05);CCK8法和transwell法检测结果表明,在缺氧环境中表达增加的AQP9对SMMC-7721和Huh-7细胞增殖和侵袭的抑制作用比常氧状态下明显增强(P<0.05);在低氧微环境中,蛋白质印迹法检测结果显示SMMC-7721-AQP9和Huh-7-AQP9细胞的Akt磷酸化(pAKT),MTOR磷酸化(pMTOR)和HIF-1α蛋白的表达水平明显低于SMMC-7721-PWPI和Huh-7-PWPI细胞(P<0.05),其中免疫荧光激光共聚焦结果显示HIF-1α蛋白主要是SMMC-7721-AQP9和Huh-7-AQP9细胞的细胞核内的表达水平降低,qRT-PCR结果显示SMMC-7721-AQP9和Huh-7-AQP9细胞的血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)、人碳酸酐酶9(Carbonic anhydrase 9,CA9)、谷氨酰胺转胺酶2(Transglutaminase,TGM2)、IGF2和人α烯醇化酶(Human alpha-enolase,ENO1)基因的mRNA表达低于SMMC-7721-PWPI和Huh-7-PWPI细胞(P<0.05),人6-磷酸果糖-2-激酶(Human 6-phosphofructo-2-kinase,PFKFB3)差异不明显(p>0.05),Elisa结果显示过表达AQP9细胞的培养液中IGF2含量明显减少(P<0.05)。(第二部分)免疫组化检测25例肝癌人体标本结果显示,在肝癌组织中AQP9蛋白高表达的区域HIF-1α蛋白低表达。(第三部分)裸鼠皮下成瘤实验发现表达增加的AQP9对裸鼠皮下成瘤的生长速度有抑制作用,表达增加的AQP9可抑制实体瘤缺氧区域HIF-1α蛋白的表达。结论:缺氧微环境中表达增加的AQP9可能通过抑制HIF-1α的表达抑制人肝癌细胞株SMMC-7721和Huh-7的增殖和侵袭,其抑制作用强于常氧环境。