禽蛋生产是当今畜牧业中的高效产业之一,而禽类的产蛋性能主要取决于卵巢中卵泡的生长发育水平,并受品种、环境和饲养管理等因素的影响。禽类的大量卵泡仅少数能发育成熟,大约仅5%能发育到小黄卵泡。卵泡经过发育、选择和闭锁等机制建立起严格的等级体系,卵泡经等级前发育进入小黄卵泡库,被选择进入等级发育的优势卵泡按顺序发育,直至排卵。禽类的卵泡发育与哺乳类不同之处在于其卵泡较大而易辨认其发育阶段,而且在产蛋周期内同时存在不同发育阶段的卵泡,因而可作为研究卵泡发育和闭锁的极佳模型。因此,禽类卵泡发育调控机制的研究对于提高禽类的产蛋性能、改良禽蛋品质等具有重要的指导意义。本实验以振宁土鸡为材料,通过分离产蛋鸡等级前小黄卵泡外膜层细胞（theca externa cell, TEC）和颗粒细胞（granulosa cell, GC）,研究前列腺素（prostaglandin）、胰岛素样生长因子-I （insulin-like growth factor I,IGF-I）和花生四烯酸（arachidonic acid, A A）对TEC生长发育和功能的影响及其细胞内信号传导机制；同时还研究了槲皮素（quercetin, Que）对环境重金属镉（cadmium, Cd）引起的鸡小黄卵泡颗粒细胞毒性的修复作用,这些结果将为家禽优势卵泡的选择及繁殖生产性能的提高提供有价值的理论依据。1.等级前小黄卵泡外膜层细胞体外培养模型的建立和应用采用机械法和胶原酶法消化分散成年产蛋鸡等级前小黄卵泡外膜层组织,用0.5%去类固醇胎牛血清和M199培养液建立TEC体外培养模型,12 h后TEC贴壁呈梭状生长,用3β-HSD染色鉴定TEC,BrdU掺入法检测黄体生成素（LH）对TEC增殖活性的影响。结果表明,利用去类固醇胎牛血清体外培养TEC,细胞生长良好而且避免了血清中类固醇激素对药物的可能影响,是一种评价外源性激素离体生物效应的简易、快速和准确并且易于观察的良好模型,可用于TEC增殖活性调控及相关功能的研究。2.前列腺素对外膜层细胞的促增殖作用及其机理研究本实验研究了前列腺素（PGE1）对等级前小黄卵泡TEC增殖的作用及其作用机理。单层培养的TEC用0.5%去类固醇胎牛血清预培养12 h后换培养液继续进行培养,同时单独添加前列腺素PGE1（0.1～100 ng/ml）或LH（0.1-100 IU/ml）处理24 h。当PGE1浓度在0.1～10ng/ml范围时,TEC的增殖作用呈上升趋势,当浓度达到100 ng/ml时,其作用呈下降趋势,其中10 ng/ml的PGE1促增殖作用最显著；LH的作用效果与PGE1类似,以10 IU/ml浓度的促增殖作用最为明显。PGE1作用机理的研究结果表明,应用前列腺素受体EP2阻断剂SC19220（10-7₁0-5mol/L）分别与LH或PGE1联合处理后,LH和PGE1的促增殖作用均被显著抑制,且呈剂量效应；前列腺素合成酶抑制剂消炎痛（10-7～10-5mol/L）与LH联合后,LH对TEC的促增殖作用也呈剂量效应被抑制。同时PGE1对小黄卵泡TEC促增殖作用的信号转导途径的研究表明：通过添加PKA、PKC信号途径激活剂及其相应的抑制剂（H89和H7）,发现PKA信号转导系统在PGE1的促小黄卵泡TEC增殖过程中起主导作用；BrdU免疫细胞化学测定结果与上述结果呈相同趋势。转录因子CREB1免疫细胞组化结果表明,PGE1可促进细胞核因子CREB1核转位；半定量RT-PCR结果也表明PGE1显著上调了细胞周期蛋白（CCND1和CCNE1）和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK6和CDK2）及转录因子CREB1mRNA的表达,这种上调作用可被H89、SC19220或消炎痛显著抑制。同时,卵泡体外培养的结果表明：PGE1（10 ng/ml）显著增加了外膜层的厚度和细胞密度。上述结果表明PGE1可通过LH介导的细胞内PKA信号转导系统激活核内转录因子CREB1,上调细胞周期蛋白（CCND1和CCNE1）和细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶（CDK6和CDK2）基因的表达,促进小黄卵泡TEC的增殖,进而调节鸡等级前卵泡的发育。3.前列腺素和胰岛素样生长因子的互作对外膜层细胞增殖作用影响本实验研究前列腺素（PGE2）和IGF-I间的相互作用对鸡等级前小黄卵泡TEC增殖影响。结果表明：当IGF-I浓度在1-100 ng/ml范围时,TEC的增殖作用呈上升趋势,当浓度达到1000 ng/ml时,其作用呈下降趋势,其中100 ng/ml的IGF-I促增殖作用最明显；PGE2增殖作用趋势同IGF-I类似,在10 ng/ml的促增殖作用最显著。IGF-I作用机理研究发现：IGF-I受体（IGF-IR）抑制剂AG1024（10-6～10-8mol/L）、蛋白激酶B（PKB&AKT）抑制剂KP372-1（10-6～10-8mol/L）、环氧和酶-2（COX-2）抑制剂NS398（10-6～10-8mol/L）与IGF-I联合处理后,IGF-1的促增殖作用被显著抑制,且呈剂量效应；Real-time PCR和ELISA结果发现IGF-I显著提高了外膜层细胞COX-2 mRNA的表达和PGE2的分泌,与AG1024、KP372-1、NS398联合处理后COX-2的表达水平和PGE2分泌量均被显著降低；同时IGF-I与NS398联合后再添加PGE2的补救实验发现,PGE2对NS398抑制的IGF-I诱导的TEC的增殖有明显补救作用,这表明COX-2在介导IGF-I促增殖作用中发挥重要作用。此外KP372-1显著抑制PGE2促增殖作用,而SC19220抑增殖作用不明显；Real-time PCR结果表明PGE2显著上调了COX-2mRNA的表达,这种上调作用受到KP372-1和NS398明显抑制,同时PGE2和IGF-I皆显著提高了IGF-IR的表达,AG1024降低了二者诱导的IGF-IR表达。卵泡体外培养结果发现IGF-I（100 ng/ml）、PGE2（10 ng/ml）及IGF-I+PGE2处理组可显著增加小黄卵泡中外膜层的厚度和细胞密度,其中以IGF-I+PGE2联合处理组效果最明显。上述结果表明IGF-I与其受体结合后通过PKB信号通路,激活了COX-2表达,促进了内源性PGE2的合成分泌,而PGE2与其细胞膜上特异性的受体结合后一方面上调IGF-IR的表达,通过PKB信号通路,止反馈激活COX-2表达,协同IGF-I刺激生成内源性PGE2,另一方面通过PKB介导,激活下游相关因子,最终促进细胞增殖。这表明1GF-I和PGE2形成了一个细胞内的正反馈循环通路,通过不同信号间的交互作用,加速了小黄卵泡外膜层细胞的增殖,进而促进了鸡等级前卵泡的发育。4.花生四烯酸对外膜层细胞增殖、活性及功能的影响AA是一类顺式多不饱和脂肪酸,是动物细胞膜磷脂的重要组成部分,作为前列腺素合成的前体物在调节动物生殖过程中发挥重要作用。本实验研究了花生四烯酸对TEC增殖、活性及功能的影响。结果表明AA（10-4～10-7mol/L）对TEC没有明显的促增殖作用,但是可以显著增强细胞活性,10-6mol/L时细胞活性最强,同时PKC抑制剂H7（10-8～10-6mol/L）与AA联合后,AA对细胞活性的增强作用呈剂量效应被抑制。AA对细胞的功能研究发现：AA（10-6mol/L）激活了PKC,促进其从胞质到膜的转位；上调了钙粘连蛋白（E-cadherin）、β-连锁蛋白（p-catenin）和缝隙连接蛋白-43 （Connexin-43）的表达,同时增强了细胞对IV型胶原粘附性；此外流式细胞结果也表明AA对细胞的凋亡有抑制作用。当添加H7（10-7mol/L）与AA（10-6mol/L）联合处理后,AA（10-6mol/L）对钙粘连蛋白、β-连锁蛋白和缝隙连接蛋白-43的表达上调作用被显著抑制,同时细胞对IV型胶原黏附性也显著下降。上述结果表明AA可能通过PKC介导,上调钙粘连蛋白、β-连锁蛋白和缝隙连接蛋白-43的表达及细胞对Ⅳ型胶原黏附性,增强了细胞间信息交流,提高了细胞活性,抑制了细胞凋亡,从而发挥其调控细胞功能的作用,进而促进鸡等级前卵泡的发育。5.槲皮素对镉引起的鸡小黄卵泡颗粒细胞毒性的缓解作用槲皮素是属于黄酮类化合物的一种,在蔬菜和水果等植物中含量丰富,具有抗癌,抗炎,抗氧化和抗凋亡等重要的生物学功能。镉是一种广泛存在的环境污染物,可以引起自由基的产生和氧化损伤,进而导致生殖系统的损伤。为此,本研究利用产蛋鸡小黄卵泡颗粒细胞培养模型研究了槲皮素对镉诱导的颗粒细胞损伤的缓解作用及其机理。结果表明氯化镉（5μM）处理24 h后显著降低了颗粒细胞的数目和细胞活性,诱导了脂质过氧化作用引起丙二醛（MDA）含量增加,GSH-Px和SOD活性降低,激活了Caspase-3,促进其从胞质到核的转位,导致细胞线粒体的收缩和DNA片段化。Western-blot和半定量RT-PCR结果表明氯化镉诱导了促凋亡蛋白BAX的表达,抑制了抑凋亡蛋白BCL2和XIAP的表达；同时颗粒细胞通过Annexin V/PI双染经流式细胞仪分析和Tunel免疫细胞化学测定也表明镉主要通过诱导了颗粒细胞的凋亡而导致细胞的死亡。添加槲皮素（1μg/ml）可显著降低MDA生成量,恢复GSH-Px和SOD活性；同时刺激BCL2和XIAP的表达,抑制BAX的表达和Caspase-3激活,从而降低了细胞凋亡的比率。上述结果表明槲皮素可以通过氧化损伤的修复和调节凋亡相关基因的表达及抑制Caspase-3的活性来缓解镉对颗粒细胞造成的毒性作用,这也表明槲皮素对重金属镉引起的细胞毒性具有潜在的保护作用。以上实验结果表明：用0.5%去类固醇胎牛血清和M199培养液建立外膜层细胞体外培养模型,能够用于研究外膜层细胞的分化、增殖、形态变化以及这种专一性细胞的相关信号转导通路。在此模型上发现PGE1通过LH介导的细胞内PKA信号转导系统促进细胞周期运转及核内转录因子CREB1的表达,进而促进小黄卵泡TEC的增殖；IGF-I则通过PKB信号通路上调COX-2的表达进而增加了PGE2的合成,而后形成了一个细胞内的正反馈循环通路,并通过不同信号转导通路的交联,加速了小黄卵泡外膜层细胞的增殖,从而促进了等级前卵泡的发育。而AA通过PKC介导,增强外膜层细胞粘附和信息交流,提高了细胞活性,抑制了细胞凋亡,从而发挥其调控细胞功能的作用。因此,AA及其代谢物PG可通过改变小黄卵泡TEC的增殖和分化等功能,促进卵泡的发育。同时我们也证实了黄酮类化合物槲皮素可以通过氧化损伤的修复和调节凋亡相关基因的表达及抑制Caspase-3的活性来缓解镉对小黄卵泡颗粒细胞造成的毒性作用。这些发现将为家禽优势卵泡选择及繁殖性能的提高提供理论指导和实验平台。