大肠杆菌O157:H7是一种重要的人畜共患病原菌,也是主要的食源性致病菌之一,自1982年发现以来在国内外一直有着较高的发病率和死亡率。又由于其强耐酸性、低感染剂量、多传播途径和易于培养等特点,已成为全球性的公共卫生问题。在食品加工及贮藏过程中,多种应激环境可对有害菌产生抑制甚至杀灭效应。然而,研究发现亚致死应激可能诱导残存的致病菌产生应激耐受响应,同时还可能增强其毒力特性,进而产生更高的食品安全风险。乳酸是发酵食品、酸性食品等的主要应激因子,这类食品在加工贮藏过程中,乳酸水平的逐步增加以及其他应激因子的存在可能对致病菌产生亚致死效应,进而可能诱导致病菌产生应激耐受。目前关于乳酸适应-酸应激、乳酸-盐联合应激对大肠杆菌O157:H7不同菌株的存活及其毒力基因表达的差异,尤其是应激过程中的动态变化方面的研究尚少见报道。因此,本实验首先对牛粪牛肉中分离鉴定的大肠杆菌O157:H7及收集的菌株进行乳酸抗性比较,进而选取酸不同抗性的毒力基因阳性菌株,研究其在乳酸适应-乳酸应激、乳酸-盐联合应激下的存活和毒力基因表达的变化,分析其菌株差异性并进一步探讨两者之间的相关性。本研究可为大肠杆菌O157:H7的食品安全风险评估提供理论依据,为实际生产加工中大肠杆菌O157:H7综合防腐措施的有效实施提供科学思路。具体研究内容和结果如下:1、牛源性大肠杆菌O157:H7的分离鉴定及其耐酸性比较研究采集309份牛粪样和牛肉样,增菌后,免疫磁珠富集,涂布于科玛嘉选择性培养基,纯化可疑菌株对其大肠杆菌O157:H7特异基因rfbO157、H7特异基因fliCH7进行PCR检测,进一步进行生化鉴定、血清学鉴定、免疫胶体金快速检测。采用多重PCR方法鉴定分离株的4种毒力基因（eae、hly、stx1、stx2）,最后对上述分离株及其他收集的菌株共24株大肠杆菌O157:H7分别进行盐酸（pH 2.0）和乳酸（pH 3.5）应激,比较其耐酸性差异。结果共鉴定出7株大肠杆菌O157:H7,1株大肠杆菌O157:NM,大肠杆菌O157阳性检出率为2.59%。毒力基因检测表明,8株菌株均不携带stx1和stx2基因,其中6株菌株携带eae及hly基因。耐酸性试验表明,盐酸或乳酸处理2 h后24株菌株菌数均显著下降,但下降程度呈现明显菌株差异性,同一菌株对盐酸、乳酸呈现明显的耐受差异。2、乳酸适应-酸应激对大肠杆菌O157:H7存活及其毒力基因表达的影响在上述实验基础上,挑选出6株乳酸耐受能力不同的大肠杆菌O157:H7,进行乳酸适应-酸应激试验。经pH5.0乳酸适应不同时间（1、2、3和4h）再分别进行pH3.5乳酸应激不同时间（30、60、90和120min）,比较乳酸适应-乳酸应激对不同菌株存活的影响。结果表明,乳酸应激后6株大肠杆菌O157:H7存活菌数均显著减少,但减少程度不完全相同。酸适应后各菌株乳酸抗性变化存在差异,菌株J42乳酸抗性未发生显著性变化,菌株CICC21530乳酸抗性并未增强,且酸适应1 h时各应激组比未酸适应组反而减弱。其他4株菌乳酸抗性显著增强,且菌株89在酸适应3 h时、菌株95在酸适应4 h时、菌株109和菌株112均在酸适应3 h和4 h时,获得最高乳酸抗性。进一步采用Real-time PCR方法定量分析乳酸适应-酸应激后毒力基因表达的变化。结果表明各菌株变化存在差异,且同一菌株不同毒力基因变化不同。乳酸应激后菌株95 stx1表达量增加,其eae表达量减少,其他他菌株各毒力基因减少或无显著性差异。酸适应增加了菌株CICC21530 stx1、stx2、eae和菌株89、菌株J42eae、hly在一些应激处理组的表达,而酸适应减少了菌株95 stx1、eae和菌株109、菌株112eae、hly在一些应激处理组的表达。综合细菌存活和毒力基因表达实验结果,发现乳酸适应-酸应激时两者之间不存在相关性。3、乳酸-盐联合酸应激对大肠杆菌O157:H7存活及其毒力基因表达的影响在上述实验基础上,挑选出3株乳酸耐受能力不同的大肠杆菌O157:H7进行乳酸-盐联合应激试验,联合应用pH 3.5乳酸与不同浓度盐（0%、6%、12%、18%）分别应激0、3、6、9、12、24、36、48和72 h。细菌存活结果表明,对大肠杆菌O157:H7CICC21530、95、109三株菌存活影响最大的均是单独乳酸应激组。当pH 3.5的乳酸与三种不同浓度的盐联合应激时,实验后期发现盐的存在显著增强了 3株菌的抗酸能力,且3株菌分别是6%、12%、18%盐浓度与乳酸联合应激时抗酸能力最强。单独盐应激对3株菌的抑制效果存在差异。与单独盐应激相比,酸与一定浓度盐联合应激时存活菌数显著降低,表明酸-盐联合抑菌效应高于单独盐抑菌作用。进一步采用Real-time PCR方法定量分析乳酸-盐联合应激后毒力基因表达的变化。结果表明,3株菌株在整个应激过程中毒力基因表达量的变化各不相同。与应激前相比,应激后3株菌株的一些毒力基因表达量显著增加。联合应激24h时,菌株CICC21530和菌株95的乳酸-高浓度盐（18%）联合应激组高于其他大多数应激组,而菌株109的乳酸-低浓度盐（6%）联合应激组显著高于其他各应激组。综合细菌存活和毒力基因表达实验结果,发现酸盐联合应激时两者之间不存在相关性,应激后3株菌株存活数均下降,而一些毒力基因表达量却显著增加。