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本试验主要探讨了laminin在奶牛体外受精及胚胎发育中的影响,同时对提高牛体外胚胎数量与质量的方法进行了研究,旨在建立一套比较完善的IVP技术体系。主要研究内容为:卵母细胞的体外成熟、体外受精及整合素β1在精卵融合中的作用、评价胚胎质量技术的优化和早期胚胎的体外培养。研究结果如下:1.卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟的影响试验结果显示:添加离散卵丘细胞能够显著促进DOs的体外成熟(57.98±14.27 vs35.53±14.00,P<0.05),对COCs具有促进趋势但差异不显著(76.66±5.77 vs 66.76±9.46,P>0.05);卵母细胞胞外卵丘细胞对与之共培养的DOs的体外成熟促进作用效果不明显(35.83±18.32 vs 35.53±14.00,P>0.05)。分析结果显示:卵母细胞胞外卵丘细胞主要通过间隙连接促进卵母细胞的体外成熟,添加的离散卵丘细胞主要以旁分泌途径促进卵母细胞的体外成熟;3层及其以上胞外卵丘细胞能够提高其包裹的卵母细胞平均体外成熟能力的85.34%,添加的离散卵丘细胞能够提高COC平均体外成熟能力的16.18%,能够提高DO平均体外成熟能力的60.61%。2.不同受精液及有无卵丘细胞对牛体外成熟卵母细胞体外发育的影响试验研究了体外成熟卵母细胞在IVF-100、BO液和TALP液三种体外受精液中的受精效果,同时比较了裸卵(NOs)与卵丘卵母细胞复合体(COCs)对受精效果的影响。结果显示体外成熟卵母细胞在受精液IVF-100中的卵裂率显著高于BO液的(0.7055±0.0745 VS0.5794±0.0956,P<0.05),而TALP液中的卵裂率与IVF-100和BO液的差异都不显著。NOs的卵裂率虽然低于COCs的,但差异不显著;NOs能够发育到囊胚阶段,但囊胚率极显著低于COCs的。说明BO液和TALP液作为体外受精液还有很大的改进空间,NOs的体外发育能力显著低于COCs的。3.laminin在牛早期胚胎中的分布及添加层粘连蛋白对体外胚胎发育的影响将经IVM-IVF的牛卵子移入含不同浓度laminin(0、5、10 and 20μg/ml)的体外培养基中进行培养,并对不同阶段胚胎的发育情况进行检测。结果显示10μg/ml组卵裂率及囊胚率显著高于对照组(0.8031±0.0667 vs 0.7039±0.0688,P<0.05;0.4835±0.0167 vs0.3765±0.0257,P<0.05)。虽然受精48h后各试验组4-8cell数与对照组之间差异不显著,但5、10μg/ml组的囊胚细胞团总数显著高于对照组(97.00±8.24、98.71±13.59 vs87.86±6.22,P<0.05)。在滋养层细胞数上试验组与对照组之间无差异,各组内细胞团数与囊胚细胞团总数的比值均接近0.33。在对0-8天牛体外胚胎层粘连蛋白的分布检测试验显示,最早可于8细胞胚胎检测到laminin的表达分布,在16细胞到囊胚阶段层laminin的表达呈递增趋势,并于桑囊胚阶段大量表达。在囊胚及扩张囊胚阶段同时还能检测到滋养层细胞laminin部分的表达分布情况。结果表明:laminin随胚龄的增加需求量不断加大,添加一定量的的外源性laminin能够在不同程度上提高体外胚胎的卵裂率、囊胚率以及囊胚细胞数;运用免疫荧光技术最早可于8细胞阶段检测到奶牛胚胎laminin的表达分布,而且在桑囊胚阶段能够检测到laminin的大量表达。4.牛体外胚胎质量评定技术的优化为建立快速、可靠的评估牛囊胚质量的双重染色方法,本试验对4种双重染色方案进行了改进。结果显示改进的方案一、方案三及方案四都能达到牛囊胚双重染色的效果。改进的方案三、方案四囊胚细胞总数与Hoechst33342染色结果无差异(84.33±9.98 VS83.63±9.74,P>0.05;93.00±10.50 VS83.63±9.74,P>0.05),而且囊胚内细胞团(ICM)数与囊胚细胞总数的比值分别为0.3382与0.3356,均接近0.33。改进的方案四染色最为稳定,效果较好,整个染色时间不到3分钟,极大的提高了染色效率。试验结果表明改进的方案三、方案四都可以作为一种快速简洁有效的牛囊胚质量鉴别方法。5.整合素β1在精卵融合中的作用此试验通过不同条件下laminin与anti-β1对整合素β1的阻断来探索整合素β1在精卵融合中的作用,同时对laminin特意消失于受精阶段的原因进行分析。结果显示当分别用laminin与anti-β1对卵子上的整合素β1进行阻断时,laminin能极显著的影响受精(10μg/ml:67.38±5.41,20μg/ml:71.51±4.96 VS 86.04±3.73,P<0.01)及卵裂(10μg/ml:41.43±8.33VS 59.30±7.85,P<0.01),而anti-β1对受精及卵裂的影响不大。当分别将laminin与anti-β1添加到受精液中,对laminin肝素受体进行封闭时,结果显示随laminin浓度的升高,对精卵融合的影响显著增加(10μg/ml:80.36±1.92 VS 86.04±3.73,P>0.05;20μg/ml:64.95±7.61 VS86.04±3.73,P<0.01),但对卵裂的影响不大;而anti-β1能极显著的影响受精(50μg/ml:29.49±11.39,100μg/ml:34.98±7.54 VS 86.04±3.73,P<0.01)及卵裂(50μg/ml:5.44±7.37,100μg/ml:3.65±6.84 VS 59.30±7.85,P<0.01)。当分别用laminin与anti-β1对精子表面上的整合素β1进行阻断时,结果显示两者都显著的影响受精及卵裂(P<0.05),而且laminin浓度越大,显著性越强。同时,当分别用laminin与anti-β1对精子表面和卵子表面整合素β1进行阻断再进行体外受精时,结果显示两者都极显著的影响精卵的融合(P<0.01),卵裂率上除50μg/ml anti-β1组外都极显著的低于对照组(P<0.01)。结果表明,整合素β1参于了奶牛体外精卵融合的过程;阻断精子表面上的整合素β1能极显著的阻碍精卵的融合,而阻断卵子表面上的整合素β1对受精影响不大;laminin在受精过程中的消失可能是由于对整合素β1及肝素的阻断而阻碍了精卵的正常融合。