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海洋球石藻(Coccolithophores)是一类单细胞海洋微型浮游植物,广泛分布于世界范围的近海和大洋水域中,在地质学、生物地理学、古气候学、生态生理学、材料科学和医学等领域中具有重要的研究价值。作为大洋环境中重要的初级生产者,海洋球石藻能够产生丰富的次级代谢生物活性物质,在生物技术研究领域具有广阔的应用前景。球石藻细胞能够合成大量聚酮类化合物,具有良好的抗菌、抗虫、抗肿瘤等生物学活性。引人注目的是,球石藻中最重要的种类Emiliania huxleyi能被特异性病毒感染并随着宿主细胞的裂解释放出大量神经酰胺类(Ceramide)物质,这可能是由于病毒在某种程度上控制着宿主神经酰胺的代谢过程,并通过大量合成神经酰胺类物质诱导宿主细胞凋亡。神经酰胺是细胞中的一种信号传导物质,对细胞分化、增殖、免疫、凋亡及衰老等生命活动具有重要调节作用。作为一种新型的生物活性物质,神经酰胺特有的生理功能及药物功效使其成为一种附加值极高并具有巨大市场潜力的活性物质,在化工、医药、食品、特别是高档护肤品等领域中具有广阔的应用前景。神经酰胺在细胞中的含量甚微,一般在0.01?0.2%(干重)左右。海洋球石藻E.huxleyi在病毒感染条件下,其细胞中神经酰胺的含量可达到细胞干重的0.091%。尽管与其他生物相比,其细胞中神经酰胺相对含量并不是很高,但球石藻神经酰胺独特的结构特点使其生物学活性远远高于任何陆地生物来源的神经酰胺。微藻基因工程是一种复杂而快速发展的生物技术,可作为操纵微藻代谢通路的强有力工具。通过微藻基因工程技术可以改造海洋球石藻鞘脂类合成代谢途径的关键环节,使其有利于高效合成并积累神经酰胺,从而有效提高细胞中神经酰胺的产量。目前有关海洋球石藻遗传转化系统及其应用研究国内外尚未见报道。本论文以海洋球石藻E.huxleyi(EhBOF92)及其特异性裂解病毒EhV-99B1为研究对象,构建海洋球石藻真核表达载体、建立其遗传转化方法,在此基础上将病毒基因组中神经酰胺合成第一限速酶丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)催化亚基LCB2基因亚克隆入表达载体并转化宿主藻细胞,检测LCB2基因表达水平及其对宿主细胞神经酰胺合成的影响。主要研究结果如下:(1)抗生素抗性基因的筛选及其克隆:选择氨苄青霉素、卡那霉素、G418、氯霉素、链霉素、新生霉素及嘌呤霉素等7种常用抗生素和除草剂草铵膦,以球石藻生长率为指标,从上述化学物质中筛选适宜的抗生素。结果表明,海洋球石藻对氨苄青霉素、卡那霉素和链霉素等不敏感,对氯霉素和新生霉素较敏感,而对G418、嘌呤霉素和草铵膦则高度敏感。综合分析最终选择G418作为球石藻基因工程藻株的选择性抗生素,其对应的抗性基因neo作为构建海洋球石藻真核表达载体的选择标记基因。从pSELECT载体中PCR扩增获得neo基因并通过测序验证。(2)启动子及报告基因的选择:从pGFP载体中PCR扩增获得绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因并通过测序验证;采用生物信息学方法筛选启动子,并对启动子序列进行综合分析。本文选择球石藻内源性fcp(岩藻黄素叶绿素a/c结合蛋白启动子)启动子,从基因组中PCR扩增该基因并利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和Plant CARE(http://bioniformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)数据库对其序列中的顺式作用元件、增强子和阻遏因子等进行预测和分析。结果表明,fcp启动子序列包含大量的顺式作用元件,具有潜在的强启动子活性。(3)表达载体的构建及其转化方法的建立:以pUC18为基础载体,成功构建了双元重组表达载体pUC18-gfp-fcp和pUC18-fcp-neo,利用电击法共转化海洋球石藻。转化条件的优化结果为:选择对数中期细胞,质粒DNA浓度为10μg/mL(高纯度),电击缓冲液为0.080 mol/L KCl、0.005 mol/L CaCl2、0.2 mol/L甘露醇、0.2 mol/L山梨醇、0.01 mol/L Hepes、pH 7.2,电场强度为2000 V/cm,电击时间为2 ms/次、电击2次。荧光显微镜及实时荧光定量PCR验证结果表明:成功获得转化的藻细胞,转化效率为0.07%。fcp启动子能够在球石藻细胞中启动gfp基因和neo基因的相对高效的表达。(4)球石藻病毒SPT对宿主神经酰胺合成的影响:从病毒基因组中克隆SPT(EC2.3.1.50)的催化亚基LCB2基因片段,构建了含有EhV99B1-LCB2基因的重组表达质粒pUC18-fcp-neo-LCB2,采用电击转化法将其与重组质粒pUC18-gfp-fcp进行共转化导入球石藻细胞中,经PCR验证获得含有病毒LCB2基因的球石藻基因工程藻株。通过高效液相色谱(HPLC)法对藻细胞中神经酰胺含量进行检测。结果表明:球石藻转化组细胞中神经酰胺含量达到45.25 fg/cell,是对照组的1.2倍,说明EhV99B1-LCB2一定程度上能够促进宿主细胞神经酰胺的合成。本研究初步建立的海洋球石藻稳定的遗传转化系统将为进一步开发功能获得型突变藻株(如病毒基因组中能够促进宿主细胞神经酰胺合成的基因)或基因敲除突变体藻株(如敲除神经酰胺水解酶基因)提供技术工具,为实现新型神经酰胺类物质产业化奠定基础。