病毒性心肌炎(viral myocarditis,VMC)是由嗜心肌病毒感染引起的炎症性心脏疾病,是引起40岁以下青年人猝死和心力衰竭的主要原因之一。VMC的主要发病机制与病毒直接损害心肌和病毒入侵后激活炎症因子引起的炎症免疫反应有关。尽管已有的研究表明T细胞在VMC中起重要作用,尤其是Th1和Th17,但是针对T细胞的研究仍未能完全解释VMC的发病机制。B细胞是另外一种重要的免疫细胞,主要调节体液免疫反应。B细胞的主要功能是分泌抗体、抗原呈递和分泌细胞因子。传统对B细胞的研究主要针对其分泌抗体,近年来越来越多的研究表明,B细胞分泌抗体以外的功能在自身免疫疾病中起更重要作用。我们的前期研究表明调节性B细胞(Breg,B细胞的其中一个亚群)在VMC中起调节免疫作用。然而,B细胞在VMC中作用及其作用机制如何?目前尚未见相关报道。为了进一步了解B细胞在VMC中的作用以及阐明B细胞在VMC中的作用机制,深入阐明VMC的发病机制,指导临床治疗。本课题应用C57BL/6小鼠腹腔注射柯萨奇病毒B3(Coxsackie virus B3,CVB3)建立VMC小鼠模型,进行以下三方面研究。第一部分B细胞的免疫学特征在小鼠病毒性心肌炎中的变化研究一目的:应用C57BL/6小鼠腹腔注射CVB3方法建立VMC模型,观察VMC小鼠不同时期心肌的病理改变。方法:雄性4周龄C57BL/6小鼠72只,随机分为VMC组(n=40)和对照组(n=32),两组小鼠均设1、2、3、4周4个时点亚组。其中VMC组每个亚组10只小鼠,对照组每个亚组8只小鼠。采用腹腔注射CVB3为VMC组,腹腔注射等体积磷酸盐缓冲液(PBS)为对照组。两组小鼠在规定时点处死,留取心脏,用苏木精-伊红染色(hematoxylin&eosin,HE)染色了解心肌病理变化及计算心肌病理积分。结果:小鼠心肌在CVB3感染后第1周时炎症最重,可见心肌细胞肿胀,大量炎症细胞浸润和局灶性坏死,第2周后炎症逐渐减轻。计算心肌病理积分结果显示,VMC组小鼠心肌病理积分在第1周明显升高,并达高峰,第2周开始降低,与对照组相应时点比较有显著性差异(P<0.01)。结论:VMC模型成功,且炎症最重在CVB感染后第1周。研究二目的:观察在小鼠VMC的发病过程中B细胞分泌抗体、抗原呈递能力和分泌细胞因子的变化,探讨B细胞的免疫学特征在VMC中的变化及意义。方法:研究对象和分组同研究一。用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测血清IgA、IgM和IgG浓度,用流式细胞术检测脾脏B细胞总数、B细胞表达CD40、CD69、CD80、CD86和MHC-II变化以及B细胞分泌细胞因子TNF-α、IL-4、IL-6和IL-17的变化。结果:VMC组血清IgG、IgM水平、B细胞表达CD40、CD69、CD80和MHC-II均在第1周明显升高(P<0.01),并达高峰,第2周后逐渐降低(P<0.01),但在第4周仍然高于对照组(P<0.05),而VMC组血清IgA水平和B细胞总数与对照组比较均无显著差异(P>0.05)。但是VMC组B细胞表达CD86则在第1周开始下降(P<0.01),在第2周明显降低(P<0.01),第3周逐渐升高(P<0.01),在第4周与对照组相当(P>0.05)。B细胞分泌的TNF-α、IL-6和IL-17在VMC组第1周明显升高(P<0.01),第2周开始逐渐下降(P<0.01),第4周降至与对照组相当(P>0.05)。而B细胞分泌的IL-4在VMC第1周和第2周则明显低于对照组(P<0.01),在第3周和第4周与对照组比较无显著差异(P>0.05)。结论:B细胞分泌免疫球蛋白、抗原呈递能力和分泌的抗炎细胞因子均在VMC急性期明显升高并达高峰。第一部分总结论:B细胞在VMC急性期明显活化,B细胞分泌免疫球蛋白、抗原呈递能力和分泌的促炎细胞因子均在VMC急性期明显升高并达高峰。提示B细胞有可能参与VMC的发病过程。第二部分B细胞在小鼠病毒性心肌炎中的作用研究一目的:观察B细胞缺失(BKO)后对心肌损伤的影响,探讨B细胞在VMC中的作用。方法:野生型(WT)C57BL/6小鼠16只,分为对照组和WT组,每组各8只;BKO小鼠8只,为BKO组;严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠16只,分为SCID组和SCID+B细胞组,每组各8只,所有小鼠约为4-6周龄的雄性小鼠。其中SCID+B细胞组:将来源于VMC第7天C57BL/6小鼠脾脏分选出来的的B细胞在注射CVB3前3天腹腔注射进SCID小鼠体内。除对照组注射PBS外,其余各组均注射CVB3病毒建立VMC模型。用HE染色观察各组心肌病理变化并计算心肌病理积分,用ELISA测血清肌钙蛋白T水平。结果:BKO组和SCID组心肌病理积分比WT组和SCID+B细胞组均明显降低(P<0.01),差异有统计学意义,BKO组分别与WT组和SCID+B细胞组比较差异有统计学意义(P<0.01);SCID组分别与WT组和SCID+B细胞组比较差异也有统计学意义(P<0.01),但是BKO组与SCID组比较、WT组与SCID+B细胞组比较差异均无统计学意义(P>0.05)。血清肌钙蛋白T结果与心肌病理积分一致。结论:B细胞在VMC中的致病作用无需T细胞辅助,可单独通过B细胞分泌的细胞因子在VMC中起致病作用。研究二目的:探讨B细胞缺失后对IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-22细胞因的影响。方法:WT C57BL/6小鼠和BKO小鼠各8只,分别为WT组和BKO组。均腹腔注射CVB3病毒,建立VMC模型。VMC1周时小鼠被处死,留取采血和心脏。ELISA测血清IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-22的浓度,实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)测心肌细胞因子IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-22的mRNA表达。结果:与WT组相比,BKO组血清IFN-γ和IL-17浓度均显著下降,P<0.01;而BKO组血清IL-4的浓度则相反,比WT组显著升高,P<0.01;但是血清IL-22浓度在两组之间无统计学差异,P>0.05。心肌IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-22的mRNA表达结果与血清蛋白水平结果一致。结论:在VMC中,B细胞促进IFN-γ和IL-17分泌,抑制IL-4的分泌。第二部分总结论:B细胞在VMC中起致病作用,无需T细胞辅助,且有可能通过影响辅助T(Th)细胞反应起作用。第三部分B细胞在小鼠病毒性心肌炎中对Th细胞分化的影响研究一目的:观察B细胞缺失后Th1、Th2、Th17和Th22细胞数及其相关转录因子T-bet、GATA-3、RORγt以及AHR mRNA表达的变化。方法:WT C57BL/6小鼠和BKO小鼠各8只,分别为WT组和BKO组,均腹腔注射CVB3病毒,建立VMC模型。VMC1周时处死小鼠,留取心脏和脾脏。用流式细胞术测脾脏Th1、Th2、Th17和Th22细胞数,用RT-qPCR测心肌T-bet、GATA-3、RORγt以及AHR mRNA表达水平。结果:BKO组Th1和Th17细胞数比WT组均明显下降(P<0.01),但是Th2细胞数比WT组显著升高(P<0.01),Th22细胞数在两组之间比较无显著差异(P>0.05)。心肌T-bet和RORγt的mRNA表达在BKO组比WT组显著下降(P<0.01),而GATA3的mRNA表达在BKO组则比WT组显著升高(P<0.01),AHR的mRNA表达在两组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:B细胞在VMC中可能促进Th1和Th17细胞分化,抑制Th2细胞分化。研究二目的:体外实验验证B细胞在小鼠VMC中对Th细胞分化的影响。方法:实验对象和动物分组同本部分研究一,VMC1周时处死小鼠,留取脾脏,用磁珠从VMC小鼠脾脏中分离B细胞,从BKO组小鼠和WT组小鼠脾脏中分离初始CD4+T细胞,体外培养诱导Th细胞分化。体外培养分为三组:(1)WT组:从WT组小鼠脾脏中分离初始CD4+T细胞;(2)BKO组:从BKO组小鼠脾脏中分离初始CD4+T细胞;(3)BKO+B细胞组:从BKO组小鼠脾脏中分离的初始CD4+T细胞与从VMC小鼠脾脏中分离的B细胞共同培养。用流式细胞术测Th1、Th2、Th17和Th22细胞数;用ELISA测细胞上清液IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-22蛋白水平,用RT-qPCR测相关转录因子T-bet、GATA-3、RORγt以及AHR表达水平的变化。结果:Th1和Th17细胞数、上清液IFN-γ和IL-17的浓度以及T-bet和RORγt的mRNA表达水平在BKO组均比在WT组和BKO+B细胞组明显降低(P<0.01),Th2细胞数、上清液IL-4的浓度以及GATA-3的mRNA表达水平则在BKO组均比在WT组和BKO+B细胞组明显升高(P<0.01),而Th22细胞数、上清液IL-22的浓度以及AHR的mRNA表达水平在三组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论:体外实验表明B细胞可促进Th1和Th17细胞分化,抑制Th2细胞分化。第三部分总结论:B细胞在VMC中可促进Th1和Th17细胞分化,抑制Th2细胞分化。全文总结:(1)B细胞在VMC急性期明显活化,B细胞分泌的免疫球蛋白在VMC急性期明显升高并达高峰,B细胞的抗原呈递能力和分泌细胞因子能力均在VMC急性期明显增强。(2)B细胞在VMC中起致病作用且无需T细胞辅助,B细胞分泌的细胞因子在VMC中起促进心肌损伤作用,B细胞在VMC中可促进IFN-γ和IL-17分泌,抑制IL-4的分泌。(3)B细胞在VMC中可促进Th1和Th17细胞分化,抑制Th2细胞分化。