第一部分:PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学功能的影响背景三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)是一种特殊的乳腺癌亚型,雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor,PR)、人表皮生长因子受体-2 (human epidermal growth factor receptor 2,HER-2)均阴性。TNBC 缺乏有效的靶向治疗,对内分泌治疗、常规化疗不敏感,具有高度侵袭性,预后差,其临床治疗是个非常棘手的问题。肿瘤的发生和发展是一个多基因参与,多步骤、多阶段的病理过程,由信号转导通路异常所引起的细胞生长和死亡之间的平衡被打破是肿瘤发生和发展的重要机制之一。PI3K/AKT/mTOR被认为是TNBC中最重要的信号通路之一。目前,有关TNBC中PI3K/AKT/mTOR信号通路机制的研究较少,该信号通路中相关基因活化水平的改变是否导致TNBC细胞生物学行为的变化,以及通路中相关靶点的分子抑制剂是否会在乳腺癌的治疗中发挥重要作用,值得深入研究。目的本研究旨在探讨TNBC中PI3K/AKT/mTOR通路相关分子mRNA水平的表达情况,以MDA-MB-231乳腺癌细胞为研究对象,通过使用P13K和mTOR的特异性抑制剂LY294002和Everolimus,观察两药在体外单独及联合应用对于人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖、周期阻滞与凋亡的影响,旨在探讨针对该通路不同靶点的联合抑制是否具有协同抗肿瘤效应。方法1样本采集从我院常规治疗手术中收集了 40对三阴性乳腺癌组织和相邻的正常组织。所有样本均获得知情同意,并经医院机构审查委员会批准。2 RNA提取和实时定量PCR使用Trizol试剂提取从三阴性乳腺癌组织中提取总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计检测RNA的纯度和浓度。使用PrimeScript(?) RT Enzyme Mix逆转录酶将RNA转化成cDNA,然后在7500实时PCR系统上使用SuperReal PreMix Plus试剂与PI3K、AKT、mTOR引物进行qPCR。使用GAPDH作为标准化的内参,并使用2-ACT ( CT=CT mRNA-CT GAPDH)方法来分析mRNA的相对量。相对于对照组,将mRNA表达的变化以倍数表示。3细胞培养人乳腺癌细胞株MDA-MB-231是从北京协和医学院细胞资源中心获得,并在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。将细胞置于37℃和5% C02的恒温培养箱中培养。4细胞增殖检测用CCK-8法检测细胞增殖,将MDA-MB-231细胞接种在完全培养基中,24小时后用RPMI-1640代替,并将细胞继续培养48小时。将100μL培养基中的约3000个细胞接种在96孔板中,24小时后替换200μL含有LY294002和/或Everolimus的完全生长培养基。细胞培养5天,每组设有5个复孔。当细胞增殖实验开始时,向培养基中加入10 μL CCK-8溶液,然后将板置于37℃培养箱中。4小时后,使用ELx800通用酶标仪检测450 nm处的吸光度以评估细胞数。5细胞周期检测用 LY294002 和/或 Everolimus 处理 MDA-MB-231 细胞(1.5×105 /孔)5 天。然后用PI和RnaseA对细胞进行染色。通过流式细胞术检测细胞周期。6细胞凋亡检测用 LY294002 和/或 Everolimus 处理 MDA-MB-231细胞(1.5×105 /孔)5 天。然后用FITC标记的抗膜联蛋白V抗体对细胞进行染色。通过流式细胞术利用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒进一步分析细胞凋亡。7统计分析收集至少五次独立实验的平均值作为实验结果。所有数据均以均值±标准差表示。使用多因子方差分析进行分析,然后用GraphPad PRISM软件包进行Tukey事后检验。当P<0.05时,差异有统计学意义。结果1 PI3K、AKT、mTOR在三阴性乳腺癌组织中表达情况RT-PCR结果表明,与癌旁组织相比,PI3K、AKT、mTOR在三阴性乳腺癌组织中的相对表达水平显著升高(P<0.05)。2 LY294002或/和Everolimus处理对MDA-MB-231细胞增殖的影响LY294002处理后MDA-MB-231细胞的活性比空白对照显著降低,差异具有显著性(P<0.05)。Everolimus处理后,MDA-MB-231细胞的活性无明显变化(P>0.05)。而LY294002和Everolimus联用时,MDA-MB-231细胞的活性降低最为显著。3 LY294002或/和Everolimus处理对MDA-MB-231细胞周期的影响LY294002或Everolimus单独处理与空白组相比,G1期比例明显上升,细胞阻滞于G1期,且两药联用时效果优于单独使用(P<0.05)。4 LY294002或/和Everolimus处理对MDA-MB-231细胞凋亡的影响LY294002或Everolimus单独处理与空白组相比,凋亡率明显上升(P<0.05),两两药联用时效果优于单药使用(P<0.05)。结论1 PI3K、AKT、mTOR在三阴性乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁的正常组织,PI3K、AKT、mTOR可能在三阴性乳腺癌的发生发展过程中发挥着重要的调节作用。2抑制PI3K/AKT/mTOR通路可抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖。3抑制PI3K/AKT/mTOR通路可使三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231阻滞于G1期。4抑制PI3K/AKT/mTOR通路可诱导三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡。第二部分:丹参酮ⅡA对乳腺癌细胞他莫昔芬敏感性的影响及其机制研究背景乳腺癌是女性中第二常见的癌症类型,根据雌激素受体(estrogen receptor,ER)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)和人表皮生长受体 2 (human epidermal growth receptor 2, HER2)的表达可将乳腺癌分为三种亚型,对乳腺癌患者化疗的选择起指导作用。然而,乳腺癌患者在化疗过程中往往会对化疗药物产生耐药性。他莫昔芬早已在乳腺癌治疗中已被广泛应用,治疗成功与否主要取决于乳腺癌中ER的表达。然而,有很大比例对治疗有效应答的患者最终会产生对他莫昔芬的耐药。因此,寻找可有效预防或逆转他莫昔芬耐药的方案可能对乳腺癌的治疗带来益处。丹参酮ⅡA (Tanshinone ⅡA,TSA)是从中药丹参中提取的一种脂溶性的二蔽醌类化合物。TSA广泛应用于心血管、脑血管和绝经后综合征的治疗。研究表明,TSA具有很强的抗氧化和抗炎特性。然而,最新研究表明TSA对ER阳性和阴性乳腺癌细胞都具有很好的抗癌功效。TSA可通过表观遗传修饰Aurora A的表达和功能来抑制乳腺癌细胞的生长。此外,TSA还可以逆转化疗耐药。TSA通过下调HIF-1α阻断上皮-间质转化,缺氧诱导的乳腺癌细胞系化疗耐药。有趣的是,TSA已被证明改变了心肌细胞中各种微小RNA的表达。然而,关于TSA对乳腺癌细胞系中miRNA表达的影响知之甚少。MiRNA在调节多种基因的表达中发挥重要作用。越来越多的研究报道miRNA参与调节他莫昔芬抗性。雌二醇治疗增加了 MCF-7细胞中miRNA-98和miRNA-21的积累,这种miRNA表达的变化可能会改变患者对他莫昔芬治疗的反应。此外,雌二醇可降低miRNA-181a和miRNA-26a的表达,从而抑制细胞增殖。越来越多研究发现,miRNA包括 miRNA-375、miRNA 221/222、miRNA-200、miRNA-342 和 miRNA-519a,可作为他莫昔芬反应的潜在生物标志物。目的本研究旨在研究TSA对他莫昔芬耐药性的影响。为此,我们建立了一种MCF-7细胞衍生的他莫昔芬耐药乳腺癌细胞系(即MCF-7-TamR),评估了他莫昔芬和TSA处理对MCF-7和MCF-7-TamR细胞增殖和凋亡的影响。同时,探讨了 TSA对他莫昔芬耐药性影响的可能机制。方法1细胞培养人乳腺癌细胞株MCF-7是从北京协和医学院细胞资源中心获得,并在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。通过将MCF-7细胞连续暴露于他莫昔芬(1μM,在0.1%乙醇中稀释)超过12个月,建立他莫昔芬耐药乳腺癌细胞系MCF-7-TamR。将细胞置于37℃和5% C02的恒温培养箱中,MCF-7-TamR细胞系显示ER阳性。2细胞增殖检测用CCK-8法检测细胞增殖,将MCF-7或MCF-7-TamR细胞接种在完全培养基中,24小时后用RPMI-1640代替,并将细胞继续培养48小时。将100μL培养基中的约3000个细胞接种在96孔板中,24小时后替换200 μL含有他莫昔芬或丹参酮ⅡA的完全生长培养基。细胞培养5天,每组设有5个复孔。当细胞增殖实验开始时,向培养基中加入10μL CCK-8溶液,然后将板置于37℃培养箱中。4小时后,使用ELx800通用酶标仪检测450 nm处的吸光度以评估细胞数。3细胞凋亡检测在含有1 μM他莫昔芬的完全生长培养基中,用0.1%乙醇(对照)或TSA处理MCF-7或MCF-7-TamR细胞(1.5×105/孔)5天。然后用FITC标记的抗膜联蛋白V抗体对细胞进行染色。通过流式细胞术利用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒进一步分析细胞凋亡。4软琼脂集落形成实验采用软琼脂集落形成实验检测MCF-7和MCF-7-TamR细胞的集落形成能力。向35 mm细胞培养皿中加入含有0.5%琼脂糖的1.5 mL FBS补充培养基形成基础琼脂。然后将大约5000个细胞接种在基础琼脂上方含有0.35%琼脂糖的1.5mL培养基中。对于他莫昔芬和TSA处理,将他莫昔芬和/或TSA加入基础琼脂上方的2 mL液体培养基中并分散。然后将细胞置于37℃、5% C02培养箱中培养10天。细胞经95%乙醇固定后,0.005%结晶紫染色,显微镜下计细胞克隆数。5 RNA提取和miRNA的定量实时PCR0.05μM TSA处理5天后,使用Trizol试剂提取从MCF-7和MCF-7-TamR细胞中提取细胞总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计检测RNA的纯度和浓度。使用TaqMan(?) MicroRNA逆转录试剂盒将RNA转化成cDNA,然后在7500实时PCR系统上使用 TaqMan(?) Small RNA Assay 试剂盒与 miR-22、miR-221、miR-222、miR-200a、miR-200b、miR-200c进行qPCR。使用U6RNA作为标准化的内参,并使用2-ACT ( CT=CTmicroRNA-CTU6RNA)方法来分析miRNA的相对量。相对于对照组,将miRNA表达的变化以倍数表示。6 Western blot0.05μM TSA 处理 5 天后,使用 Western blot 检测 c-myc (65 kDa)的表达。将 MCF-7或MCF-7-TamR细胞在含有无EDTA蛋白酶抑制剂、1 mM苯基甲基磺酰氟和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液中裂解。然后将每个样品加入20 μL 2×样品上样缓冲液中,样品在上样前煮沸5分钟,使用10%的凝胶跑胶。将凝胶在转移缓冲液中转移到相同大小的硝酸纤维素转移膜上,45V下40分钟,并用封闭缓冲液稀释的c-Myc 一抗(1/1000)进行孵育过夜。将膜用TTBS洗涤三次,然后加入在封闭缓冲液稀释的二抗(1/5000),孵育2小时。TTBS洗涤以减少背景色。使用ECL试剂盒将结果可视化,并以GAPDH为参照将蛋白质水平归一化,并使用Tanon Gel图像系统进行定量。7统计分析收集至少五次独立实验的平均值作为实验结果。所有数据均以均值±标准差表示。使用多因子方差分析进行分析,然后用GraphPadPRISM软件包进行Tukey事后检验。当P<0.05时,差异有统计学意义。结果1他莫昔芬或TSA处理对MCF-7和MCF-7-TamR细胞增殖的影响他莫昔芬处理后,MCF-7-TamR细胞的增殖明显高于MCF-7细胞(P <0.001),并且他莫昔芬以剂量依赖的方式降低了 MCF- 7和MCF-7-TamR细胞的增殖(P <0.001)。此外,MCF-7细胞中他莫昔芬的最低有效剂量为0.5μM (P<0.01),而MCF-7-TamR细胞中他莫昔芬的最低有效剂量为5μM (P <0.01)。因此,以1 的他莫昔芬为最佳剂量,进一步研究TSA对他莫昔芬耐药性的影响。TSA以剂量依赖的方式降低了 MCF-7和MCF-7-TamR细胞的增殖(P <0.001)。然而,与他莫昔芬的效果相反,高剂量的TSA(≥0.1μM)治疗可以降低MCF-7和MCF-7-TamR细胞的增殖(P>0.05)。具体来说,TSA的最低有效剂量为0.1 μM,细胞增殖明显加快(P <0.01)。2 TSA和他莫昔芬联合对MCF-7和MCF-7-TamR细胞增殖、克隆形成和凋亡的影响在0.1%乙醇和1 μM他莫昔芬的处理下,MCF-7-TamR细胞增殖较MCF-7细胞更高(P<0.O01) ,而 0.05μM TSA 处理降低了 MCF-7 或 MCF-7-TamR 细胞的增殖(P<0.001)。0.05μMTSA单独处理对MCF-7或MCF-7-TamR细胞增殖无影响。具体来说,0.05μM TSA和1μM他莫昔芬联合处理将MCF-7-TamR细胞增殖降低至与0.1%乙醇处理后的MCF-7细胞相似的水平。用0.1%乙醇和1μM他莫昔芬处理的MCF-7-TamR细胞与MCF-7细胞相比,具有更高的克隆数(P <0.01)。然而,0.05μM TSA和1 μM他莫昔芬治疗减少MCF-7MCF-7-TamR细胞克隆数(P <0.001)。在0.1%乙醇和1μM他莫昔芬的处理下,MCF-7细胞凋亡较MCF-7-TamR细胞多(P <0.05),而 0.05 μM TSA 处理增强了 MCF-7 或 MCF-7-TamR 细胞的凋亡(P<0.001)。此外,0.05 μM TSA处理将MCF-7-TamR细胞凋亡增加到与0.1%乙醇处理后的MCF-7细胞相似的水平。3 TSA处理对MCF-7和MCF-7-TamR细胞中miRNA表达的影响0.05μM TSA处理后,与MCF-7细胞相比,MCF-7-TamR细胞中miRNA-22和miRNA家族(包括200a、200b和200c)的表达减弱,而miRNA 221/222表达则增强细胞(P <0.001)。然而,0.05 μM TSA处理仅改变了 MCF-7或MCF-7-TamR细胞中miRNA-22的表达(P <0.001)。具体来说,0.05μM TSA处理将MCF-7-TamR细胞中miRNA-22的表达增加至与0.1%乙醇处理后MCF-7细胞中相似的水平。4 TSA处理对MCF-7和MCF-7-TamR细胞中c-Myc表达的影响与MCF-7细胞相比,MCF-7-TamR细胞中c-Myc的表达显著增加(P <0.01)。然而,0.05μM TSA处理降低了 MCF-7或MCF-7-TamR细胞中c-Myc的表达(P <0.05)。具体来说,0.05 μM TSA处理将MCF-7-TamR细胞中c-Myc的表达降低至与0.1%乙醇处理后MCF-7细胞中相似的水平。结论1 TSA以剂量依赖的方式明显减少MCF-7和MCF-7-TamR细胞的增殖。2 TSA和他莫昔芬联合用药可显著抑制MCF-7和MCF-7-TamR细胞的增殖、克隆形成,并诱导细胞凋亡。3与MCF-7细胞相比,乳腺癌耐药MCF-7-TamR细胞中miRNA-22和miRNA 200家族(包括200a、200b和200c)的表达减弱,而miRNA 221/222表达则增强。TSA处理可显著增强MCF-7-TamR细胞中miRNA-22的表达。4与MCF-7细胞相比,乳腺癌耐药MCF-7-TamR细胞中c-Myc的表达显著增加。TSA处理则降低了 MCF-7-TamR细胞中c-Myc的表达。5 TSA可以促进体外他莫西芬耐药乳腺癌细胞治疗的敏感性,并可能涉及miRNA-22和c-Myc信号通路。