目的1.建立生物材料中异烟肼的衍生化薄层色谱扫描快速定性检测方法和高效液相色谱快速分析方法。2.建立动物的异烟肼毒物动力学、动态分布、死后分布、死后再分布和分解动力学研究动物模型。3.研究异烟肼致死动物体内的毒物动力学、动态分布、死后分布、死后再分布和分解动力学,为异烟肼中毒(死)案件的法医学鉴定提供实验依据。方法1.衍生化薄层色谱扫描和高效液相色谱检测:血、组织样品经水杨醛衍生化处理后,经乙酸乙酯萃取,氯仿:甲醇(9:1)展开后,薄层色谱扫描法定性检测其中异烟肼;经水杨醛衍生化处理后,以磷酸二氢钾-甲醇(65:35)为流动相,高效液相色谱分析,外标法定量检测其中异烟肼。2.异烟肼在家兔体内的毒物动力学研究:家兔6只,LD50剂量(280mg/kg)异烟肼灌胃,每只分别于给药后0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、6h各颈动脉取血1mL。水杨醛衍生化处理,薄层色谱扫描法定性,高效液相色谱外标法定量检测其中异烟肼。3.异烟肼在家兔体内的动态分布研究:家兔15只,LD50剂量(280mg/kg)异烟肼灌胃染毒,分别于0.75、1、2、4、6h处死,迅速解剖动物,取心、肝、脾、肺、肾、脑、胃壁、肌肉等组织。水杨醛衍生化处理,薄层色谱扫描法定性,高效液相色谱外标法定量检测其中异烟肼。4.异烟肼在家兔体内的死后分布研究:家兔6只,2倍LD50剂量(560mg/kg)异烟肼灌胃染毒,待家兔血压、呼吸和心电全部消失后,迅速解剖动物,取心血、心、肝、脾、肺、肾、脑、胃壁、肌肉等组织。水杨醛衍生化处理,薄层色谱扫描法定性,高效液相色谱外标法定量检测其中异烟肼。5.异烟肼在家兔体内的死后再分布研究:雄性大鼠54只,1/2LD50剂量(330mg/kg)异烟肼灌胃染毒,1h后处死,置于20℃保存,不同时间(0、4、8、12、24、48、72、96h)各随机取6只,采取脑、心、肺、肝、脾、肾、肌肉、心血、胃壁。水杨醛衍生化处理,薄层色谱扫描法定性,高效液相色谱外标法定量检测其中异烟肼。6.异烟肼分解动力学研究:①染毒检材中异烟肼分解动力学研究。犬6只,4倍LD50剂量(800mg/kg)异烟肼灌胃染毒1h后处死,解剖动物,取心血和肝。每只犬心血和肝分四等份,其中三份分别置于20℃、4℃、-20℃保存;另一份心血中加氟化钠至1%,另一份肝脏加4%甲醛溶液固定,20℃保存;分别于0h、12h、24h、48h、72h、5天、3周、4周、2月、3月、4月、5月、6月、7月、8月衍生化薄层色谱扫描法和高效液相色谱法检测其中异烟肼。②空白人血添加异烟肼分解动力学研究。取100ml空白人血,加入异烟肼纯品10mg,超声振荡,静置24 h,分三份,保存于20℃;分别于0h、12h、24h、48h、72h、5天、3周、4周、2月、3月、4月衍生化薄层色谱扫描法和高效液相色谱检测其中异烟肼。7.统计学方法:采用SPSS11.5统计软件处理数据,结果以均数±标准差( )表示,t检验。药物浓度-时间数据采用WinNonlin药代动力学软件处理。结果1.症状LD50剂量组家兔在灌药后,30min后出现呼吸抑制、昏迷、周身强直性痉挛,呈癫痫大发作样抽搐,1.5-2h后症状缓解,实验动物逐渐恢复正常。2倍LD50剂量组家兔在灌药后30min左右出现呼吸抑制、昏迷、全身阵发性强直性痉挛,呈癫痫大发作样抽搐,有不同程度的共济失调,于2h±30min死亡。2.毒物动力学异烟肼在家兔的毒物动力学过程呈一级动力学特征,符合一室开放模型,吸收速率常数(K01):5.828h-1;吸收半衰期(t1/2k01):0.1189h;达峰时间(tmax):0.847h;消除速率常数(K10):0.5702h-1;消除半衰期(t1/2k10):1.2156h;表观分布容积(V):4156.55L/kg;血药浓度-时间曲线下面积(AUC):118.138;峰浓度(Cmax):52.3538μg/ml;滞后时间(lag time):0.4075h。3.动态分布异烟肼染毒(LD50:280mg/kg)后0.75、1、2、4、6h处死家兔,其体内异烟肼含量由高到低依次为胃、肾、肝、心、肺、脑、脾;肝、胃、肾、肺、脑、脾、心;胃、肝、肾、肺、脑、心、脾;胃、肾、肝、心、脑、脾、肺;胃、肾、肝、心、肺、脑、脾。各脏器中异烟肼的毒物动力学过程也呈一级动力学特征,符合血管外给药一室开放模型,达峰时间为0.961-1.416 h。心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脑和胃的消除半衰期分别为2.323h、2.052h、0.359h、2.093h、4.887h、0.955h、3.465h。4.死后分布2倍LD50剂量染毒死亡家兔体内异烟肼含量为:胃(131.59±15.3μg/g)>肾(52.98±8.6μg/g)>血(45.4±12.2μg/g)>玻璃体液(40.8±16.3μg/ml)>心(31.224±16.15μg/g)>脑(28.2±8.5μg/g)>脾(25.62±1.37μg/g)>肺(20.89±5.18μg/g)>肌肉(20.3±7.5μg/g)>肝(18.5±12.61μg/g)。5.死后再分布20℃保存时,死后2h大脑中异烟肼含量开始显著升高(P<0.05);4h后大鼠心血、肺中异烟肼含量开始显著升高(P<0.05);8h后心肌、肝、脾和肾中异烟肼含量开始显著升高(P<0.05);心血、心、大脑中异烟肼含量死后12h达高峰,肝、脾、肾等脏器中异烟肼含量死后48h达高峰,肺中异烟肼含量死后8h达高峰。胃壁、肌肉中含量无显著变化。死后大鼠肺、脾、肾、心、心血、肝中异烟肼含量变化较脑、肌肉、胃壁明显。6.保存检材中分解动力学20℃、0℃、-20℃和4%甲醛固定(20℃)保存染毒犬肝脏中,异烟肼含量在保存第12、12、24和48h显著下降(P<0.05);20℃、0℃、-20℃、1%氟化钠(20℃)保存染毒犬血液中,异烟肼含量在保存第12、24、24和48 h内显著下降(P<0.05)。保存血和肝中异烟肼的分解动力学均呈一级动力学过程。可用Ct=Ae-αt+Be-βt表达,20℃,4℃,-20℃和4%甲醛溶液固定保存染毒犬肝中,异烟肼的分解速率常数k和分解半衰期t1/2分别为4.75×10-3h-1、6.07 d, 2.74×10-3h-1、10.50 d,0.829×10-3h-1、35.69 d,0.178×10-3h-1、162.56 d;20℃,4℃,-20℃保存和1%氟化钠犬血液中异烟肼的分解速率常数k和分解半衰期t1/2分别为5.48×10-3h-1、5.27d,1.33×10-3h-1、21.61d,0.739×10-3h-1、39.13d,0.279×10-3h-1、103.34d;人血中添加异烟肼的分解动力方程为Ct=14.233e-0.0176t+71.512e-0.00026t,分解速率常数k和分解半衰期t1/2分别为0.078×10-3(h-1)和289.9d。小结1.本文建立了生物检材中异烟肼的衍生化薄层色谱扫描快速定性和高效液相色谱定量检测方法,定性快速,定量准确,操作简便,可应用于异烟肼中毒(死)案件的法医学鉴定和法医毒物动力学研究。2.本文建立了异烟肼的毒物动力学、动态分布、死后分布、死后再分布和分解动力学研究动物模型,可应用于异烟肼的法医毒物动力学研究。3.异烟肼在家兔体内的毒物动力学过程呈一级动力学特征,符合一室开放模型,心血中异烟肼的达峰时间为0.847h,消除半衰期为1.2156h;各脏器中异烟肼的达峰时间为0.961-1.416 h,各脏器中消除半衰期分别为0.359h- 4.887h。4.染毒后不同时相家兔体内异烟肼的动态分布趋势不同,提示法医学实践中可用各脏器中异烟肼的分布情况判断死亡时相。5.2LD50剂量染毒家兔体内异烟肼死后分布(胃>肾>血>玻璃体液>心>脑>脾>肺>肌>肝)与LD50剂量染毒家兔后2 h的动态分布(胃>肾>玻璃体液>肺>脑>血>心>肝)不同,提示不同剂量染毒家兔体内异烟肼死后分布趋势不同,异烟肼中毒(死)案件法医学鉴定时,宜采取肾、玻璃体液、脑等受剂量影响小的脏器,并应考虑中毒量及中毒死亡时间,进行全面定性和定量分析。6.异烟肼在大鼠体内存在死后再分布,死后室温下保存,大脑、心血、肺、心肌、肝、脾、肾中异烟肼含量均可显著升高,而胃壁、肌肉中含量无显著变化。提示异烟肼中毒(死)案件法医学鉴定中应考虑死后再分布对心血异烟肼浓度的影响,应在死后4-8 h内解剖,并应同时取死后再分布影响小的检材外周血和肌肉同时检测异烟肼含量。7.异烟肼在保存血和肝脏中均可发生分解,保存温度降低,肝脏甲醛固定或血中添加1%氟化钠可减慢其分解,说明冷冻、抑菌剂或甲醛固定可减慢异烟肼的分解;人血中添加异烟肼分解较慢,说明异烟肼在保存检材中分解动力学有种属差异性。因此,异烟肼中毒案件的法医学鉴定中毒分检材应在12-48h内送检和检测,若不能及时送检应冷冻保存,血液可添加1%氟化钠,固性组织检材可用甲醛固定,尽快检验。若解剖后较长时间送检或检验,可用人血中异烟肼分解动力学参数推断中毒死亡当时尸血中异烟肼浓度。