论文部分内容阅读
鸭肠炎病毒(duck enteritis virus, DEV)是疱疹病毒科(Herpesviridae)、α疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)、马立克氏病毒属(Mardivirus)的成员之一。UL13基因编码的蛋白是疱疹病毒保守性蛋白激酶(Conserved herpesvirus protein kinase, CHPK)家族成员之一。目前有关DEV UL13功能研究的资料尚很缺乏,因此作者对其进行了生物信息特征、原核表达及多克隆抗体的制备、UL13蛋白激酶活性、细胞内定位、核定位特性、功能等方面的研究,主要结果如下：1鸭肠炎病毒CHv株UL13基因生物信息特征DEV UL13基因完整ORF为1575bp,编码含524个氨基酸的肽段,整条肽链不具备信号肽和跨膜区,有潜在的糖基化位点9个和磷酸化位点34个,有两个潜在的核定位信号分别位于肽段4-7及90-96位氨基酸残基处,296-305氨基酸位点显示为潜在核输出信号。密码子分析显示UL13基因偏向使用A/T结尾的密码子,密码子使用模式与酵母的最为接近。DEV UL13蛋白的二级结构分析显示其有多个抗原决定簇,均匀分布在整条肽链中,三级结构预测其与疱疹病毒的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族成员高度相似,属于疱疹病毒保守性蛋白激酶家族成员之一,通过序列比对其179位氨基酸为激酶发挥最大活性所必需的保守性赖氨酸位点。2鸭肠炎病毒UL13基因克隆、原核表达及多克隆抗体的制备将DEV UL13基因第486-1158位碱基序列克隆至原核表达载体pET32c(+)上,将重组表达载体导入大肠杆菌BL21(DE)中进行融合表达,通过对表达条件进行优化,确定了30℃、IPTG浓度为0.2 mM诱导表达5h能获得最高表达量。获得了大小约44 kDa带His标签的UL13非可溶形式的包涵体蛋白。该表达蛋白能被兔抗DEV多克隆抗体特异性识别。用亲和层析的方法纯化UL13重组蛋白,复性后免疫兔子获得兔抗DEV UL13蛋白血清,能特异性识别感染细胞中的DEV。3鸭肠炎病毒UL13基因类型及转录、表达时相分析为确证鸭肠炎病毒UL13的基因类型,首先用更昔洛韦和放线菌酮分别处理感染了DEV的细胞,发现DEV UL13的表达仅对放线菌酮处理敏感,完全不依赖病毒的复制,说明DEV UL13为早期基因。通过反转录实时荧光定量PCR对DEV UL13基因的转录实相特征进行探索,结果表明UL13基因从病毒感染后2 h开始转录,24 h转录水平达到峰值,其相对宿主细胞β-actin基因转录水平从病毒感染后2 h起逐步上升,48 h达到峰值。同时用免疫印迹方法对DEV UL13蛋白表达时相进行探索,发现在病毒感染后4 h能被检测到,24 h表达水平达到峰值,UL13基因表达与转录水平的动态变化基本一致。4鸭肠炎病毒UL13蛋白激酶活性研究通过杆状病毒昆虫细胞表达系统对DEV UL13蛋白和对激酶活性发挥至关重要的保守性赖氨酸突变的DEV △UL13(K179M)蛋白进行了体外真核表达及纯化,测定及比较了DEV UL13蛋白和DEV △UL13(K179M)蛋白体外激酶活性的差异,并确定了DEV UL13在体外发挥最适酶活条件为50 mM Mg2+存在、pH7.2、37℃；同时纯化了UL13潜在底物蛋白,病毒编码的糖蛋白gE和Us3蛋白激酶,通过体外激酶反应初步确定Us3蛋白能被UL13蛋白磷酸化。为了进一步确定UL13蛋白对Us3蛋白的磷酸化能力、探索UL13蛋白激酶活性对病毒生长复制的影响,通过本实验室新构建的DEV感染性克隆平台,成功构建了UL13蛋白第179位赖氨酸突变为甲硫氨酸的点突变重组毒DEV CHv-BACAUL13(K179M)及回复突变毒DEVCHv-BAC△UL13(K179M) R。通过对DEV CHv-BACAUL13(K179M)重组毒与回复毒DEV CHv-BACAUL13(K179M) R、亲本毒DEV CHv-BAC进行体外生物学特性比较,发现UL13蛋白激酶失活毒株在病毒的复制能力及空斑形成方面不及亲本毒和回复毒株,说明UL13激酶活性对病毒的生长复制有重要影响,同时通过免疫印迹的方法确定DEVUL13蛋白在病毒感染的细胞内也能磷酸化Us3蛋白。5鸭肠炎病毒UL13基因编码蛋白的定位研究通过间接免疫荧光法探究DEV UL13蛋白在感染细胞内的定位情况,结果发现UL13蛋白在感染细胞的核、质中均有分布。为了确定主导UL13蛋白入核的功能信号,先通过重叠PCR技术构建了UL13蛋白潜在的核定位信号单/双缺失的突变子与GFP的融合表达,发现与天然UL13融合GFP重组蛋白相比,核定位信号单/双缺失的重组蛋白大量/全部在胞浆滞留,而且通过将核定位信号1或/和2与GFP融合表达,发现绿色荧光大量/几乎全部位于胞核。说明核定位信号1和2对于DEV UL13蛋白的入核不可或缺,且二者具有协同作用。同时通过药物抑制试验确定了UL13的核定位信号是通过与importin α/β形成复合物来调节UL13蛋白入核的。用相同的操作探究DEV UL13潜在的核输出信号功能,发现其缺失或添加并不能引起绿色荧光分布的任何变化,表明核输出信号是非功能性的。为了进一步探索DEV UL13蛋白入核的功能,作者通过本实验室新构建的DEV感染性克隆平台,成功构建了UL13蛋白缺失了核定位信号的重组毒DEV CHv-BAC UL13-ANLS。通过对DEV CHv-BAC UL13-△NLS与亲本毒DEV CHv-BAC进行体外生物学特性比较,发现DEV CHv-BAC UL13-△NLS重组毒在病毒的复制能力及空斑形成方面与亲本毒并无明显差异,说明UL13蛋白不入核对病毒的生长复制没有重大影响。通过免疫印迹法比较亲本毒和DEV CHv-BAC UL13-△NLS、DEV CHv-BAC△UL13(K179M)重组毒感染后Us3蛋白的磷酸化水平发现缺失了核定位信号的DEV UL13蛋白依然能磷酸化Us3蛋白,说明核定位信号的缺失不影响激酶活性。6鸭肠炎病毒UL13缺失重组毒构建及体外细胞培养特性研究为了探索DEV UL13蛋白影响病毒复制是否完全依赖其激酶活性的发挥,本章依赖细菌人工染色体DEV重组病毒拯救系统平台,通过两步Red重组系统构建了两个UL13蛋白部分缺失的感染性克隆,并成功拯救出UL13缺失的重组毒DEVCHv-BAC△UL13及部分缺失的重组毒DEV CHv-BAC△UL13-1(仅缺失UL13肽链激酶活性区域Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚域)和DEV CHv-BAC△UL13-2(仅缺失UL13肽链激酶活性区域Ⅵ、Ⅶ、Ⅸ亚域)。经测序鉴定及RFLP分析,这三株重组毒基因组除了人工诱发的突变外,其余与亲本无异。三株重组毒所形成的空斑明显小于亲本毒,生长复制能力也明显弱于亲本毒,这种差异在DEV CHv-BAC△UL13-2重组毒上表现尤为明显,而DEV CHv-BAC△UL13及部分缺失的重组毒DEV CHv-BAC△UL13-1与第四章构建的点突变重组毒株DEV CHv-BAC△UL13(K179M)在空斑形成及复制能力上并无明显差异。表明DEV UL13蛋白在病毒复制周期中发挥重要作用,且其功能的发挥多半依赖其激酶活性。