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肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α, TNF-α)是一种主要由活化单核巨噬细胞和T淋巴细胞产生的多效性细胞因子,与全身性炎症反应有关,参与急性期反应。TNF-α主要作用于免疫细胞的调节,可以诱导细胞凋亡,炎症反应,以及抑制肿瘤和病毒的复制,在疾病感染过程中有重要监测意义。猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratiry Syndrone Virus, PRRSV)是引起母猪生殖障碍和仔猪呼吸困难的重要病原之一。根据基因组和抗原性的差异,PRRSV分为欧洲型和美洲型,并存在多种基因亚型,不同分离株毒力差异较大,其致病机制尚不十分清楚。本研究利用原核表达系统获得纯化重组TNF-α蛋白,制备获得其单克隆抗体,并利用实时荧光定量PCR方法和商品化ELISA试剂盒分别检测PAM感染不同毒力PRRSV后TNF-α变化情况,阐明TNF-α在PRRSV感染过程中的作用。1.猪TNF-α原核表达与单克隆抗体制备根据猪肿瘤坏死因子α(TNF-α)基因设计两对引物,利用PCR扩增TNF-α成熟蛋白编码基因(534bp),构建原核表达载体PET-28a-TNF-α,并转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定,证明TNF-A重组蛋白获得表达。提取纯化该重组蛋白包涵体,免疫BALB/c小鼠,经过3次细胞融合,间接ELISA方法筛选,获得2株能稳定分泌抗猪TNF-α单克隆抗体的杂交瘤细胞,将其命名为1E2和2F3。Western blotting结果证明该单克隆抗体能够与重组蛋白发生特异性反应。间接ELISA测定细胞上清抗体效价为分别为1：512,1：1024,腹水效价均为1：128000,单抗1E2为IgG1亚型,轻链为K型,单抗2F3为IgG3亚型,轻链为κ型。杂交瘤细胞连续传代20代,分泌抗体的效价基本一致,从而为进一步建立猪TNF-α的检测方法奠定了基础。2. PRRSV不同毒株感染猪肺泡巨噬细胞TNF-α变化规律比较研究为了研究猪TNF-α在PRRSV感染中的作用,本研究将高致病性PRRSV分离株SY0608和疫苗弱毒株MLV株分别感染猪肺泡巨噬细胞(PAM),同时,以LPS(脂多糖)刺激的PAM为阳性对照,感染后2、4、6、8、10、12、24h采用实时荧光定量PCR方法检测PRRSV N蛋白mRNA和TNF-αmRNA,并以管家基因β-αctin为内参,对其进行相对定量分析。同时,用猪TNF-αELISA检测试剂盒,检测PAM培养上清中的TNF-α蛋白含量。结果为：PRRSV感染PAM细胞后,N蛋白mRNA水平逐渐升高,MLV毒株感染后病毒增殖速度较快,但SY0608毒株感染后24小时,病毒基因转录水平明显增高。PAM感染高致病性PRRSV和疫苗弱毒株感染后0-10h,TNF-αmRNA水平呈现上升趋势,10h后逐渐下降,TNF-α蛋白含量随着培养时间的延长呈现上升趋势,高致病性PRRSV感染组TNF-α水平明显高于疫苗弱毒株组,表明TNF-α在PRRSV致病机制中起重要作用。