羰基还原酶具有高度的立体异构选择性和对映体过量，反应条件温和，环境友好等优点，在手性醇中间体的生物合成领域发挥了重要的作用。获得催化活性和立体选择性均高的羰基还原酶是实现生物催化不对称合成手性醇的前提;采用生物信息学的有理设计，结合体外进化技术对酶催化性质的改造是提高生物催化剂的有效补充手段。本论文以2-氧代-4-苯基丁酸乙酯(ethyl2-oxo-4-phenylbutyrate，OPBE)为底物，从多种微生物的基因组中挖掘高立体选择性的羰基还原酶，专一性地生成（R/S）-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯(ethyl(S/R)-2-hydroxy-4-phenylbutyrate，(R/S)-HPBE)，后者可用于合成普利类系列降压药物。进而，对酶的底物谱及催化特性进行分析;针对NADPH依赖的羰基还原酶Gox0525，进行晶体结构解析及其辅酶偏好性改造，以期获得利用NADH依赖的突变酶。具体的研究内容及结果如下:　　第一，羰基还原酶的筛选与鉴定:以本实验室实现工业化应用的一株氧化葡萄糖酸杆菌出发，基于基因组挖掘技术和生物信息学分析方法，获得了12条候选的氧化还原酶基因。以多种酮、酮酯和醛类化合物为底物进行筛选，确定其中的7个酶分子表现出羰基还原活性和不同的底物特异性。其中，羰基还原酶Gox0525对OPBE具有最好的立体选择性，专一性生成S)-2-羟基-4-苯基丁酸乙酯((S)-HPBE)，对映体过量(enantiomericexcess，e.e.)大于99％;与其他酶相比，产率最高，达到了93.1％。同时，从本实验室构建的其它不同微生物来源的羰基还原酶（共25种）中筛选到一个来源于酿酒酵母的羰基还原酶(SeCR)，对OPBE表现较好的还原活性和最高的立体选择性(e.e.＞99％)，生成(R)-HPBE。　　第二，羰基还原酶Gox0525的酶学性质研究:SDS-PAGE显示重组Gox0525蛋白分子量为27.0kDa左右，在天然状态下以同源四聚体的形式呈现。能专一性地利用NADPH为辅酶，其最适pH和最适反应温度分别为9.0和30℃。Gox0525能还原脂肪族的酮、芳香酮、α-和β-酮酯等多种结构的羰基化合物，对2，3-戊二酮的还原活性最高，达到了32.4U/mg。除OPBE以外，Gox0525对4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE，ethyl4-cloro-3-oxobutyrate)，4-苯基-2-丁酮也具有非常好的选择性，e.e.分别为＞99％和97.9％。Gox0525还原芳香酮生成(R)-对映体，还原酮酯生成S)-对映体，因此其还原方式是anti-Prelog规则的，而anti-Prelog立体选择性的还原酶在自然界中发现的较少。对Gox0525的anti-Prelog立体选择性还原机制分析发现，在Gox0525-NADPH-OPBE相互作用的结构模拟图中，NADPH的烟酰胺单核苷酸环位于OPBE的si面，NADPH提供的氢原子转移到OPBE化合物的羰基上，生成了相应的(S)-HPBE。反复冻融处理的工程菌细胞在2h内将底物完全转化成产物，产率达到96.2％，而静息细胞在12h内将底物转化成产物，产物约73.4％。这些研究结果表明，Gox0525作为一种anti-Prelog立体选择性的还原酶，可用于一些anti-Prelog手性醇化合物的合成。　　第三，羰基还原酶SeCR的酶学性质研究:重组SeCR蛋白分子量为35kDa左右，在天然状态下以单体形式呈现。SeCR能专一性地利用NADPH为辅酶，其还原反应的最适pH和最适温度分别为7.5和50℃。SeCR在pH4.5～10.5范围内稳定性较好，保持了60％以上的残余活性，在PBS7.0中的稳定性最好，残余活性为94.1％。在低于40℃下，SeCR的残余活性保持90％以上。SeCR的底物谱较窄，能还原部分醛类化合物、α-酮或α-酮酯，对COBE的还原活性很小，对其他分析的β-酮酯无还原活性，其中2，3戊二酮的还原活性最高(37.1U/mg)。SeCR对COBE，OPBE，苯甲酰甲酸甲酯(MBF)和苯甲酰甲酸乙酯(EBF)的立体选择性均大于99％，且生成(R)-型产物，其还原的方式是遵循Prelog规则。通过对SeCR-NADPH-OPBE相互作用的结构模拟，发现NADPH和OPBE位于SeCR的活性巢中，且NADPH的烟酰胺单核苷酸环位于OPBE的re面，NADPH提供的氢原子转移到OPBE的羰基上，生成了(R)-HPBE，这与实验数据相符合。对SeCR工程菌全细胞催化OPBE还原的分析发现底物浓度大于10g/L时，底物浓度升高转化率和e.e均逐渐降低。这些研究结果表明，SeCR对OPBE绝对的立体选择性，可用于普利类药物的手性中间体的合成。　　第四，羰基还原酶Gox0525的结构解析及辅酶特异性改造:获得了Gox0525的晶体结构数据(PDB ID:3WTB)。分析发现Gox0525是以同源八聚体的结构存在，每个单体分子由七个平行的β-折叠组成，周围伴随着八个α-螺旋;还包含了一个典型的α/βRossmann折叠的辅酶结合区域。Gox0525是专一性地利用NADPH，基于Gox0525-NADPH相互作用的三维结构图，锁定4个可能与NADPH的2磷酸根结合相关的氨基酸位点:S12、A35、R36、N37。突变酶的辅酶偏好性分析发现，S12D，A35D，R36D三个突变酶均不能利用NADH为辅酶。A35N和A35S突变酶对NADH的活性低于0.6U/mg。而N37D，N37E和N37P突变使得Gox0525从严格的NADPH依赖性变为能利用NADH和NADPH两种辅酶。而且，N37P突变酶对NADPH的活力相比Gox0525有一定程度的提高，对NADH的活力从野生型的不能利用，提高到了43.3U/mg。N37P突变酶在NADH为辅酶的作用下催化效率非常高，达到了1231.5 s-1mM-1。突变酶N37E在NADH的作用下，活力达到了11 U/mg，催化效率为66.8 s-1 mM-1。突变酶N37P和N37E对OPBE还原的立体选择性未发生改变，仍生成(S)-HPBE，且e.e＞99％。突变酶N37P的结构模拟证明，37位的天冬酰胺突变成脯氨酸后，侧链（吡咯烷基）填补了NADPH去掉磷酸根后的空腔，增加了酶与NADH的相互作用力，从而使N37P能利用NADH。本研究借助于生物信息学的有理设计以及体外进化技术，成功实现了酶的辅酶偏好性从依赖NADPH到对NADH兼容的改造。