抗肿瘤活性蛋白的发现与研究对于新药研发及肿瘤治疗具有重要的意义。然而，许多具有生物活性的蛋白药物存在着类药性差(drug-like properties)的问题。以核糖体失活蛋白（蛋白毒素，protein toxins）为例，该类蛋白具有很强的抗肿瘤活性，但是缺乏肿瘤组织靶向及进入细胞的能力，而且其体内清除较快，半衰期很短，并具有一定的免疫原性。这些缺点极大地影响了该类成分的治疗收益及临床应用。因此，改善其类药性质是提高蛋白毒素的治疗效果，促进其向抗肿瘤临床转化的关键。　　由于蛋白质表面可供修饰的活性基团数量众多，故蛋白药物的修饰，尤其是定点修饰一直是生物制药的难点之一。蛋白质的传统化学修饰是基于蛋白表面的氨基或巯基进行反应，易形成不均一的产物或产生分子间交联。如果涉及多个功能配体修饰或偶联，复杂繁琐的多步化学反应易使蛋白变性失活;并且由于难以实行定位反应，会生成多种产物，影响产品的质控。因此，开发一种简单高效的蛋白质定点修饰方法是改善蛋白类药性的关键问题。　　本研究选取了Ⅰ型核糖体失活蛋白天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)作为研究对象，采用内含肽介导的蛋白质连接技术构建了重组TCS-穿膜肽融合蛋白以及具有肿瘤酶响应功能的TCS大分子前药型递送系统，并对其进行了表征及抗肿瘤活性评价。该递送系统的特点是，通过生物重组及化学方法在TCS上构建了三个功能元件:穿膜肽、肿瘤酶底物肽、聚乙二醇(PEG)。引入这些功能元件是为了实现三个递送目的:(1)利用PEG遮蔽穿膜肽的正电荷，降低了药物进入正常组织的暴露量;(2)PEG修饰后，增加分子的尺寸，从而有利于通过EPR效应富集于肿瘤组织;(3)底物肽可在肿瘤组织中被高表达的MMP-2酶所切断，令PEG脱离，暴露出穿膜肽，从而介导TCS蛋白进入肿瘤细胞。在体外实验中证明，该系统有较好的MMP-2酶响应性及入胞效率。与未修饰TCS相比，该系统在MMP-2酶高表达的移植瘤小鼠模型中不仅表现出较高的抗肿瘤活性，并且有更低的毒副作用和免疫原性。　　本研究还发现，该系统在体内外对紫杉醇耐药的肿瘤细胞株A549/T具有逆转耐药的作用。通过蛋白芯片技术以及Western Blot实验等多种手段对TCS蛋白逆转紫杉醇耐药的机制进行了研究，发现了TCS蛋白能够通过微管蛋白抑制以及凋亡相关蛋白的去磷酸化等多条信号通路来增加A549/T细胞对紫杉醇的敏感性，从而对抗细胞的紫杉醇耐药。　　本研究还利用具有脑靶向功能的乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)作为靶向给药配体，构建了具有脑靶向功能的肿瘤酶响应型多级靶向系统。体外实验显示该系统能够通过与脑微血管内皮细胞表面高表达LRP-1受体结合穿透血脑屏障，并通过肿瘤组织高表达的MMP-2酶实现酶切响应入胞。体内实验表明该体系在皮下瘤小鼠模型和脑原位瘤小鼠模型中具有较好的治疗效果，能够显著延长荷瘤小鼠的生存期和存活率。　　综上所述，本论文运用内含肽介导的蛋白质连接技术对重组TCS蛋白进行了定点修饰，并基于大分子前药设计策略构建了PEG化的肿瘤酶响应性肿瘤靶向给药系统与具有脑靶向功能的多级靶向给药系统。本论文在不同的体外和体内模型中证明了所构建的TCS靶向给药系统具有更强的抗肿瘤活性以及更好的体内安全性。同时，本论文还发现了TCS蛋白能够通过微管抑制与凋亡通路的调控等机制来实现对抗肿瘤细胞的紫杉醇耐药。本论文为蛋白毒素类药物的肿瘤靶向给药系统的构建，以及在抗肿瘤多药耐药中的应用提供了新的思路。