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目的:采用大鼠CLP模型观察脓毒症动物主要脏器TLR2和TLR4mRNA表达的变化规律及其组织分布特点;探讨TLR2和TLR4表达与内毒素增敏系统[脂多糖结合蛋白(LBP)/CD14]以及促炎/抗炎因子之间的关系;观察重组杀菌/通透性增加蛋白(rBPI21)和正丁酸钠对TLR2和TLR4表达的影响,初步揭示G-菌脓毒症时TLR2和TLR4的分子调控机理;阐明TLR2和TLR4在脓毒症发病过程中的作用及其与多器官功能损害的关系,为临床预防和治疗脓毒症及MODS提供新的思路。 方法:雄性Wistar大鼠120只,随机分为4组:(1)正常对照组(n=10)。(2)假手术组(只行开关腹腔术)(n=10)。(3)盲肠结扎穿孔组(n=60):按时间点分为CLP后2、6、12、24、48和72小时组,活杀动物:(3)重组杀菌/通透性增加蛋白(rBPI21)治疗组(n=20):CLP术后0.5和4小时静脉注射rBPl21,每次剂量为1mg/kg;按时间点分为12、24小时组,活杀动物;(4)正丁酸钠治疗组(n=20):CLP术后0.5和4小时静脉注射正丁酸钠,每次剂量为500mg/kg;按时间点分为12、24小时组,活杀动物。 经腹主动脉采血,分离血浆及血清标本,分别用于测定LPS、TNF-α、IL-10及血清生化指标。严格无菌采取肝、肺、肾和小肠组织,进行TLR2/TLR4、LBP/CDl4、TNF-α、HMG-1及IL-10基因表达的检测,同时测定组织中LPS、IL-10和TNF-α蛋白水平。LPS采用鲎试验基质显色法(LAL)定量测定;组织TLR2/TLR4、LBP/CDl4、TNF-α、HMG-1及IL-10mRNA表达采用半定量逆转录-聚合酶链反应技术检测;血浆TNF-α、IL-10水平采用ELISA法检测;血清ALT、AST、Cr水平使用7170自动生化分析仪测定;肺组织髓过氧化物酶(MPO)活性采用酶学分光光度法测定;小肠组织DAO 萝口军医大学硕士学位论文 活性采用分光光度法测定。 结果:1.大鼠 CLP后血浆及肝、肺组织内内毒素 2~12小时和 48~72 ’]’时呈双峰样升高。BPI干预可显著降低 12小时肝、肺、肾组织内毒素水 平,正丁酸钠处理可显著降低12小时肝、肾组织及血浆内毒素水平,对肺 组织内毒素无明显影响。二.正常大鼠肝、肺、肾及肠组织均可表达一定量 TLRZ及 TLR4 rnRNA,CLP后 6小时各组织TLRZ及 TLR4 mRNA表达均 明显增高,24小时后TLR4 mRNA表达则下降,而TLRZ mRNA持续高表 达至 72小时。BPI治疗可显著降低 12、24小时各组织 TLRZ InRNA表达, 12小时各组织 TLR4 mRNA表达亦明显下降,而对 24小时肝、肺及小肠组 织 TLR4 InRNA表达无明显影响。正丁酸钠治疗后 12小时肝、肾、肺、肠 组织TLRZ及TLR4 mRNA显著降低。3.CLP后2-48小时,肝、肺、肾 组织LBP mNA表达持续显著高于伤前基础值,小肠组织其表达仅于伤后 2、72小时显著升高;BPI及正丁酸钠处理组动物肝、肺组织 12、24小时 LBP mRNA表达均显著抑制。动物 CLP后各组织 CD14 mRNA表达均呈不 同程度地升高;BPI干预可不同程度地降低 12小时各组织及 24小时小肠组 织 CD14 mRNA表达;正丁酸钠治疗可显著降低 12 ’h时各组织 CD14 mRNA 的表达,但对 24小时其表达无明显影响。4.CLP后 2叫 2小时及 48-72 ’J\ 时,肝、肺、肾及小肠组织 TNF-or mANA表达、血浆及各脏器 hFa蛋白 水平均不同程度地呈双峰样升高。注射 BPI可不同程度地抑制 12小时多种 组织 TNF mRNA表达上调,同时降低其 TNFa蛋白水平;而正丁酸钠治疗 对血浆及各脏器TNF-a蛋白水平无明显影响。5.CLP后6~72小时各组织 HMG-lmRNA表达持续增高。正丁酸钠干预可显著抑制 12、24 ,J\时各组织 HMG.lffiRNA表达。6.CLP后 12小时各组织 ILIO基因表达及蛋白水平 均达高峰,注射 BPI及 NaB可不同程度地升高 12-24小时各组织几刁 0基因 及蛋白水平。7.CLP后大鼠血清ALT、AST、Cr、LDH、CK-MB和肺组织 MPO活性不同程度地显著升高,小肠DAO活性于伤后2~72h持续降低。 4 第四旱医大毕硕士学位论文 BPI和正丁酸钠治疗组动物血清各生化指标于术后 12小时比未治疗组显著 降低,24小时MPO活性明显降低。8.相关分析表明,CLP后肝、肺、肾 及小肠组织 TLRZ和 TLR4 mRNA表达分别与相应组织内毒素水平、TNF-a eA表达呈显著正相关;在部分组织内分别与其 LBP/CD及几-10 mRNA表达显著正相关;各组织内TLRZ与HMG-l基因表达均呈显著正相 关;各组织 TLRS rnRNA表达分别与其脏器功能明显相关。