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肝纤维化（hepatic fibrosis）是各种致病因子引起慢性肝病，进而发展为肝硬化的一个动态过程与共同病理途径。其主要病理改变是细胞外间质（extracellular matrix，ECM）的过度合成与异常沉积，肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）是参与该过程的最重要细胞，它的激活导致自身增殖和胶原合成增加，而肝纤维化恢复期HSCs凋亡明显增多。所以HSCs增殖和凋亡在肝纤维化的形成和逆转过程中起关键作用，被认为是各种肝脏损伤引起肝纤维化的中心环节。 HSCs和ECM之间的相互作用主要经整合素介导。基础研究表明，整合素与其相应配基结合后，多个粘着斑激酶（focal adhesion kinase， FAK）分子聚集在粘着斑（focal adhesion plaque， FAP）处，使FAK N-端区的酪氨酸Tyr397磷酸化而被激活。FAK激活后通过两条通路将信号向下游传递：一方面，FAK激活Tyr397，产生与Src同源区2（SH2）和同源区 3（SH3）结合的位点，引起踝蛋白、张力素等的磷酸化，从而进入Ras途径激活MAPK；另一方面，FAK的磷酸化作用产生了Grb2和mSOS 结合的位点，从而通过Grb2/SOS通路进入Ras途径，Ras最终激活MAPK，产生级联反应，影响细胞效应。 迄今为止，ECM成分骨桥蛋白（osteopontin，OPN）对血管平滑肌细胞（smooth muscle cells，SMCs）粘附、迁移<WP=5>及FAK活性影响已有报道，但OPN对 HSCs影响则少有报道。为此，我们应用体外细胞培养技术，从HSC 与ECM 之间的相互作用着手，研究了整合素信号通路在HSC粘附、迁移及对粘着斑激酶活性影响中的作用。实验内容主要包括以下两部分：第一部分：骨桥蛋白对大鼠肝星状细胞粘附、迁移和增殖 的影响 目的：探讨ECM成分骨桥蛋白对大鼠肝星状细胞粘附、迁移和增殖的影响。 方法：本研究应用体外细胞培养技术，采用MTT法了解HSCs增殖情况；采用甲苯胺蓝法了解HSCs粘附情况；参照河北医科大学分子生物学实验室方法了解HSCs迁移情况。 结果：①应用OPN包被培养板，不同浓度OPN和RGDS四肽作用于HSCs 2h，8、16、32μg·mL-1 OPN组细胞粘附促进率分别为55.65%、58.67%、45.25%，尽管各组间无统计学差异，但均高于对照组（P＜0.05 ）；25μg·mL-1 ~ 100μg·mL-1 RGDS四肽的粘附抑制率分别是13.34%、16.55%、36.31%，而RGES四肽组的粘附抑制率仅为0.77%，与对照组相比，无明显差异。RGDS四肽不同浓度组的粘附率明显下降，有统计学差异（P＜0.05 ）。②8、16、32μg·mL-1 OPN干预细胞48h后，细胞生长增殖率分别为11.12%、13.54%、10.47%；25μg·mL-1 ~ 100μg·mL-1 RGDS四肽组细胞生长抑制率分别为5.84%、12.53%、29.49% ；16μg·mL-1 OPN作用于细胞24h、48h、72h、96r促增殖率分别为34.12%、35.63%、34.37%、34.96%；100μg·mL-1 RGDS四肽作用于细胞24h、48h、72h、<WP=6>96h抑制率分别为8.53%、13.74%、17.14%、22.98%；RGES四肽对细胞生长无促进和抑制作用。③对照组细胞12h、24h、36h迁移的距离分别为（75.00±10.18）μm、（97.00±13.37）μm、（78.00±13.17）μm；16μg·mL-1OPN作用12h、24h、36h细胞迁移的距离分别为（93.00±4.83）μm、（114.00±9.66）μm、（121.00±17.29）μm，与对照组比较有统计学意义（P＜0.05 ）；100μg·mL-1 RGDS四肽作用12h、24h、36h细胞迁移的距离分别为（51.00±9.94）μm、（46.00±6.99）μm、（24.00±9.66）μm，与对照组比较有统计学意义（P＜0.05 ）；RGES四肽对HSCs迁移无明显促进和抑制作用。 结论：体外细胞培养研究表明，OPN对HSCs有促增殖作用，同时促进HSCs粘附和迁移，但无明显的时间剂量效应关系。RGDS四肽对 HSCs增殖、粘附和迁移具有抑制作用，在一定范围内，呈明显的时间和剂量效应关系。第二部分：OPN和 RGDS四肽对大鼠肝星状细胞影响的胞内信号转导机制 目的：探讨ECM成分OPN 和RGDS四肽干预HSCs过程中，HSCs胞内信号分子粘着斑激酶活性变化。 方法：本研究应用体外细胞培养技术，采用Western Blot方法测定粘着斑激酶活性变化。 结果：①Western blot 分析在大概125KD的位置上出现一条杂交带，从杂交的信号强度可知，经OPN作用后各浓度组HSCs中磷酸化FAK均有表达。与对照组相比，8、16、32μg·mL-1 OPN组磷酸化FAK表达量分别增加了6.98%、14.81%、11.56% ，这提示OPN 作为ECM 的一种成分可以显著诱导FAK活化。② RGDS四肽干预HSCs 24h后，磷<WP=7>酸化FAK表达量降低，25、50、100μg·mL-1 组分别降低了8.46%、35.69%、57.29% ；RGES四肽（100μg·mL-1）与对照组相比无明显差异。结论：①OPN 作为ECM 的一种成分可以显著诱导FAK活化。② RGDS四肽在25~100μg·mL-1 浓度范围内，可抑制磷酸化FAK的表达。