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肝纤维化(hepatic fibrosis)是各种致病因子引起慢性肝病,进而发展为肝硬化的一个动态过程与共同病理途径。其主要病理改变是细胞外间质(extracellular matrix,ECM)的过度合成与异常沉积,肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSCs)是参与该过程的最重要细胞,它的激活导致自身增殖和胶原合成增加,而肝纤维化恢复期HSCs凋亡明显增多。所以HSCs增殖和凋亡在肝纤维化的形成和逆转过程中起关键作用,被认为是各种肝脏损伤引起肝纤维化的中心环节。 HSCs和ECM之间的相互作用主要经整合素介导。基础研究表明,整合素与其相应配基结合后,多个粘着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)分子聚集在粘着斑(focal adhesion plaque, FAP)处,使FAK N-端区的酪氨酸Tyr397磷酸化而被激活。FAK激活后通过两条通路将信号向下游传递:一方面,FAK激活Tyr397,产生与Src同源区2(SH2)和同源区 3(SH3)结合的位点,引起踝蛋白、张力素等的磷酸化,从而进入Ras途径激活MAPK;另一方面,FAK的磷酸化作用产生了Grb2和mSOS 结合的位点,从而通过Grb2/SOS通路进入Ras途径,Ras最终激活MAPK,产生级联反应,影响细胞效应。 迄今为止,ECM成分骨桥蛋白(osteopontin,OPN)对血管平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)粘附、迁移<WP=5>及FAK活性影响已有报道,但OPN对 HSCs影响则少有报道。为此,我们应用体外细胞培养技术,从HSC 与ECM 之间的相互作用着手,研究了整合素信号通路在HSC粘附、迁移及对粘着斑激酶活性影响中的作用。实验内容主要包括以下两部分:第一部分:骨桥蛋白对大鼠肝星状细胞粘附、迁移和增殖 的影响 目的:探讨ECM成分骨桥蛋白对大鼠肝星状细胞粘附、迁移和增殖的影响。 方法:本研究应用体外细胞培养技术,采用MTT法了解HSCs增殖情况;采用甲苯胺蓝法了解HSCs粘附情况;参照河北医科大学分子生物学实验室方法了解HSCs迁移情况。 结果:①应用OPN包被培养板,不同浓度OPN和RGDS四肽作用于HSCs 2h,8、16、32μg·mL-1 OPN组细胞粘附促进率分别为55.65%、58.67%、45.25%,尽管各组间无统计学差异,但均高于对照组(P<0.05 );25μg·mL-1 ~ 100μg·mL-1 RGDS四肽的粘附抑制率分别是13.34%、16.55%、36.31%,而RGES四肽组的粘附抑制率仅为0.77%,与对照组相比,无明显差异。RGDS四肽不同浓度组的粘附率明显下降,有统计学差异(P<0.05 )。②8、16、32μg·mL-1 OPN干预细胞48h后,细胞生长增殖率分别为11.12%、13.54%、10.47%;25μg·mL-1 ~ 100μg·mL-1 RGDS四肽组细胞生长抑制率分别为5.84%、12.53%、29.49% ;16μg·mL-1 OPN作用于细胞24h、48h、72h、96r促增殖率分别为34.12%、35.63%、34.37%、34.96%;100μg·mL-1 RGDS四肽作用于细胞24h、48h、72h、<WP=6>96h抑制率分别为8.53%、13.74%、17.14%、22.98%;RGES四肽对细胞生长无促进和抑制作用。③对照组细胞12h、24h、36h迁移的距离分别为(75.00±10.18)μm、(97.00±13.37)μm、(78.00±13.17)μm;16μg·mL-1OPN作用12h、24h、36h细胞迁移的距离分别为(93.00±4.83)μm、(114.00±9.66)μm、(121.00±17.29)μm,与对照组比较有统计学意义(P<0.05 );100μg·mL-1 RGDS四肽作用12h、24h、36h细胞迁移的距离分别为(51.00±9.94)μm、(46.00±6.99)μm、(24.00±9.66)μm,与对照组比较有统计学意义(P<0.05 );RGES四肽对HSCs迁移无明显促进和抑制作用。 结论:体外细胞培养研究表明,OPN对HSCs有促增殖作用,同时促进HSCs粘附和迁移,但无明显的时间剂量效应关系。RGDS四肽对 HSCs增殖、粘附和迁移具有抑制作用,在一定范围内,呈明显的时间和剂量效应关系。第二部分:OPN和 RGDS四肽对大鼠肝星状细胞影响的胞内信号转导机制 目的:探讨ECM成分OPN 和RGDS四肽干预HSCs过程中,HSCs胞内信号分子粘着斑激酶活性变化。 方法:本研究应用体外细胞培养技术,采用Western Blot方法测定粘着斑激酶活性变化。 结果:①Western blot 分析在大概125KD的位置上出现一条杂交带,从杂交的信号强度可知,经OPN作用后各浓度组HSCs中磷酸化FAK均有表达。与对照组相比,8、16、32μg·mL-1 OPN组磷酸化FAK表达量分别增加了6.98%、14.81%、11.56% ,这提示OPN 作为ECM 的一种成分可以显著诱导FAK活化。② RGDS四肽干预HSCs 24h后,磷<WP=7>酸化FAK表达量降低,25、50、100μg·mL-1 组分别降低了8.46%、35.69%、57.29% ;RGES四肽(100μg·mL-1)与对照组相比无明显差异。结论:①OPN 作为ECM 的一种成分可以显著诱导FAK活化。② RGDS四肽在25~100μg·mL-1 浓度范围内,可抑制磷酸化FAK的表达。