慢性肾脏病（chronic kidney disease,CKD）因其高发病率,治疗困难且费用昂贵,成为人类公共健康的巨大威胁。肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis,RIF）是各种CKD进展至终末期肾病（end-stage renal disease,ESRD）必不可少的生物学过程。但肾间质纤维化发生的具体分子机制目前尚不明确。RIF是以肌成纤维细胞增多,炎性细胞浸润增加导致细胞外基质（extracelluar matrix,ECM）过度沉积为主要特征。成纤维细胞聚集活化参与肾间质纤维化已被证实,但越来越多的研究表明,单核-巨噬细胞的浸润和活化是促进RIF的重要因素。巨噬细胞因其具有异质性的特点,在肾间质纤维化中逐渐成为人们研究的热点,其可通过以下多种途径参与RIF的发生:（1）巨噬细胞通过感受损伤微环境的变化,趋化迁移至损伤部位,发生表型改变、增殖、凋亡等生物学过程,产生细胞因子、炎性介质等促进细胞外基质的沉积;（2）巨噬细胞合成和分泌细胞外基质及金属蛋白酶等直接参与RIF的发生与降解;（3）肾脏巨噬细胞通过巨噬细胞-肌成纤维细胞转分化（macrophage-myofibroblast transition,MMT）促进肌成纤维细胞激活导致细胞外基质沉积。巨噬细胞在RIF中的作用毋庸置疑,然而在RIF过程中,调控巨噬细胞趋化迁移、增值凋亡、表型转换和MMT的分子机制尚未完全阐明。巨噬细胞表型和功能的异质性,使其在肾脏损伤修复和纤维化进程中的调控作用更为复杂。为此,需要深入探索调控巨噬细胞异质性的分子机制及在肾纤维化中的作用,寻找其中的关键分子和信号通路。Twist基因属于碱性的螺旋-环-螺旋转录因子家族,能够与多种基因启动子区的E-box区域结合,调控胚胎发育、表皮-间叶细胞转换（epithelial-mesenchymal transition,EMT）以及纤维化等各种生物学功能。前期我们的研究证实Twist1通过调控肾小管上皮细胞EMT促进肾脏纤维化,最近研究发现转录因子Twist1通过调控肿瘤巨噬细胞招募参与肿瘤细胞的转移分化生长等生物学过程,那么Twist1巨噬细胞是否能调控巨噬细胞影响肾纤维化?转录因子Twist1是否调控巨噬细胞生物学功能?本研究通过构建巨噬细胞中特异性剔除Twist1转基因小鼠单侧输尿管结扎（unilateral ureteral obstruction,UUO）经典肾纤维化模型进一步探究这一问题。【目的】1.探索巨噬细胞中Twist1表达及其与肾纤维化的相关性。2.研究巨噬细胞中Twist1在肾纤维化中的作用机制。3.探究转录因子Twist1调控巨噬细胞极化的分子机制。【方法】1.RT-PCR、Western blot、免疫荧光及流式细胞术检测巨噬细胞中Twist1表达。2.构建巨噬细胞特异性剔除Twist1小鼠(lyz2-cre/Twist1^Flox/Flox),命名敲除鼠（KO）及转基因对照小鼠(lyz2-cre/Twist1^Flox/WT),命名野生鼠（WT）;PCR及琼脂糖凝胶电泳基因鉴定筛选转基因小鼠。3.Masson染色、HE染色、免疫组化染色观察UUO模型小鼠中肾纤维化程度。4.HE染色、免疫荧光染色及流式细胞术检测UUO模型小鼠肾脏中炎性细胞浸润程度。5.构建8¹0周龄、体重20±2g雄性小鼠UUO模型及转染siRNA-Twist1Raw264.7巨噬细胞系,免疫组化、免疫荧光染色、流式细胞术、RT-PCR、Western blot、检测UUO模型鼠巨噬细胞的浸润、趋化、极化、增殖凋亡及巨噬细胞中纤维化分子变化。6.RNA-seq检测肾脏巨噬细胞基因谱的表达变化。7.荧光素酶报告实验（luciferase reporter assay）及染色质免疫沉淀实验（chromatinImmunoprecipitation,Chip）验证巨噬细胞系中Twist1对靶分子Lgals3的调控作用。8.用SPSS19.0统计学软件进行统计分析。数值均用均值±标准差表示,样本间等级资料比较采用Kruskal-Wallis检验,均数间的比较采用t检验,率的比较采用卡方检验。P<0.05被认为有显著的统计学差异。【结果】1.Western blot及RT-PCR验证Raw264.7巨噬细胞系、骨髓来源的巨噬细胞BMDM及肾脏巨噬细胞中均有Twist1表达。且在术后0天（n=3）、术后7天（n=3）及术后14天（n=3）的UUO纤维化模型小鼠肾组织中,免疫荧光共定位发现随着纤维化程度的加重,肾间质中F4/80⁺Twist1⁺细胞增多,提示巨噬细胞中Twist1的表达与肾间质纤维化程度呈正相关。2.琼脂凝胶电泳鉴定转基因小鼠;免疫荧光共定位染色、RT-PCR及Western blot在蛋白水平及RNA水平均证实敲除鼠肾脏巨噬细胞中Twist1表达减低（n=3）（P<0.05）,表明巨噬细胞特异性剔除Twist1小鼠(Lyz2-Cre⁺Twist1^Flox/Flox)构建成功。3.为观察特异性剔除巨噬细胞中Twist1对小鼠肾纤维化的影响,病理染色观察野生鼠（n=15）和敲除鼠（n=15）UUO14天的肾纤维化程度,HE染色发现敲除鼠的炎性细胞浸润较野生鼠明显减少,Masson染色观察敲除鼠肾间质的胶原蛋白沉积较野生鼠明显减少,扫描电镜观察发现:与野生鼠相比,敲除鼠较野生鼠肾小管上皮细胞萎缩减轻,上皮细胞融合减少,线粒体空泡样变性减少（P<0.05）。4.为探究特异性剔除巨噬细胞中Twist1减轻肾纤维化的机制,构建野生鼠（n=9）和敲除鼠（n=9）UUO肾纤维化模型,在模型建立术后第3天（野生鼠和敲除鼠各3只）、7天（野生鼠和敲除鼠各3只）)、14天（野生鼠和敲除鼠各3只）收取模型鼠术侧肾脏,流式细胞术检测小鼠肾组织中巨噬细胞标志物CD11b的表达,发现野生鼠不同肾纤维化程度的肾组织中巨噬细胞百分比分别为24.3%、51.8%、64.7%,敲除鼠不同肾纤维化程度的肾组织中巨噬细胞百分比分别为9.83%、28.7%、45.4%;同时,免疫荧光观察UUO14天小鼠肾组织,发现野生鼠每高倍视野（X400）肾间质中F4/80⁺平均数量为6个,敲除鼠肾间质中F4/80⁺平均数量为2个/HP（n=3）,提示敲除鼠较野生鼠肾间质巨噬细胞浸润减少（P<0.05）。5.进一步探究特异性剔除巨噬细胞中Twist1减少肾组织巨噬细胞浸润延缓肾纤维化的机制,流式细胞术检测UUO术后3天（野生鼠和敲除鼠各3只）、7天（野生鼠和敲除鼠各3只）、14天（野生鼠和敲除鼠各3只）的肾脏巨噬细胞亚型即M1型（CD11b⁺CD86⁺）、M2型（CD11b⁺CD206⁺）的变化,发现野生鼠在UUO术后3天、7天、14天的肾组织中M1型巨噬细胞百分比分别为71.8%、74.3%、78.9%,M2型巨噬细胞百分比分别为34.1%、52.6%、71.5%,敲除鼠UUO术后3天、7天、14天的肾组织中M1型巨噬细胞百分比分别69.2%、72.9%、76.7%,M2型巨噬细胞百分比分别为25.7%、39.0%、64.6%,提示随着肾纤维化程度的加重,小鼠肾脏中M2型巨噬细胞随之增多（P<0.05）,M1型巨噬细胞没有显著变化（P>0.05）;且在UUO术后7天、14天敲除鼠肾脏M2型巨噬细胞百分比均较野生鼠明显减少（P<0.05）,而M1型巨噬细胞没有明显差异（P>0.05）;同时RT-PCR及Western blot检测特异性剔除Twist1的肾脏巨噬细胞、骨髓巨噬细胞及下调Twist1的Raw264.7的巨噬细胞系中M1型巨噬细胞标志物（iNOS、IL-1β、IL-6、TNF-α）、M2型巨噬细胞标志物（Fizz、Arg、IL-10、MR）的表达较对照组（野生鼠、NC对照组）明显降低,提示转录因子Twist1调控M2型巨噬细胞极化促进肾纤维化。6.进一步研究特异性剔除巨噬细胞中Twist1减少肾组织巨噬细胞浸润数量的机制,构建野生鼠（n=3）和敲除鼠（n=3）UUO肾纤维化模型,在模型建立术后第14天收取术侧肾脏,免疫组化发现敲除鼠较野生鼠肾组织中趋化因子受体CCR2表达明显减少（P<0.05）,RT-PCR检测敲除鼠肾脏巨噬细胞分泌的趋化因子配体CCL2表达量较野生鼠明显降低（P<0.05）,Transwell检测下调Twist1的Raw264.7巨噬细胞系的迁移能力较对照组明显降低,提示在肾纤维化中,转录因子Twist1可能调控巨噬细胞趋化影响其在肾组织中浸润。7.为更全面探究特异性剔除巨噬细胞中Twist1通减少肾组织巨噬细胞浸润数量的机制,免疫荧光共定位检测UUO后14天野生鼠（n=3）和敲除鼠（n=3）肾组织中巨噬细胞凋亡情况,观察发现敲除鼠肾间质F4/80⁺CCP3⁺表达无统计学差异（P<0.05）,提示在肾纤维化中,Twist1蛋白可能不影响巨噬细胞凋亡。8.为深入阐明Twist1调控M2型巨噬细胞极化的分子机制,我们在UUO14天野生鼠（n=18）和敲除鼠（n=18）肾脏巨噬细胞中筛选差异表达的下游靶分子,RNA-seq结果显示共有83个分子表达变化,其中Lgals3在Twist1下调的巨噬细胞中变化较明显。RT-PCR和Western blot检测巨噬细胞Lgals3的表达,IL-4刺激下调Twist1的Raw264.7巨噬细胞系及敲除鼠骨髓巨噬细胞24小时,发现Lgals3表达均显著降低（n=3）（P<0.05）。双荧光素酶报告实验和Chip实验检测Twist1直接结合到Lgals3的启动子区,发挥转录激活作用,而上调Lgals3分子M2型巨噬细胞标志物表达升高（P<0.05）。提示Twist1转录激活Lgals3表达调控M2型巨噬细胞极化。【结论】1.巨噬细胞系、骨髓来源巨噬细胞及肾脏巨噬细胞中均有Twist1表达且与肾纤维化呈正相关。2.巨噬细胞特异性剔除Twist1减轻单侧输尿管结扎小鼠肾间质纤维化。3.单侧输尿管结扎小鼠肾纤维化模型中,巨噬细胞特异性剔除Twist1减少骨髓来源巨噬细胞浸润。4.体内外实验中,下调巨噬细胞Twist1表达减少M2型巨噬细胞极化。5.Twist1转录激活Lgals3表达调控M2型巨噬细胞极化导致肾间质纤维化。