热休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)或应激蛋白表达于所有活的细胞中，并且是活细胞中最丰富的蛋白质。它们大都是高水平的组成型表达，然而HSP家族的一些成员的表达是在应激条件下被诱导的，比如热休克，去除葡萄糖等。HSPs是目前已知的最保守的分子，同一家族内高度同源。糖蛋白96(Glycoprotein96，Gp96)是热应激蛋白家族的一个成员，存在于内质网内膜上。近年来研究发现，gp96作为分子伴侣可结合细胞中的肽库。当病毒感染或肿瘤发生时，gp96可以与抗原肽结合。随后，gp96-抗原肽复合物在一个受体介导的机制作用下将抗原肽传递给巨噬细胞或其他抗原提呈细胞，经抗原提呈途径，抗原肽被呈递给MHC Ⅰ类分子，进而激活特异性CTL和记忆性T细胞，引发机体的细胞免疫反应。通常认为，在这个过程中gp96只是起抗原传递载体的作用，本身没有发生变化。 中国科学院微生物研究所的孟颂东博士首次从感染HBV的患者肝脏组织中提取的gp96蛋白上分离到与该蛋白结合的抗原肽，经氨基酸测序证实，所分离的抗原肽来自乙肝病毒核心抗原。这一成果已发表在权威杂志Lancet上(2001年)。这一发现提示在体内存在着抗原肽与gp96结合的可能性。Gp96-抗原肽复合物作为治疗HBV引起的肝细胞癌的治疗性疫苗的潜力将得到进一步研究，而同样的方法也应该适用于其他病毒引起的肿瘤病。 MDV(Marek’s disease virus)是疱疹病毒科的一种细胞结合性肿瘤病毒，严重危害养鸡业的发展，且该病毒毒力呈增强趋势。另一方面，MDV在比较医学上有更广泛的生物学意义。它是第一个能用实验证明具有致肿瘤作用的疱疹病毒；而MD也是第一个广泛使用疫苗预防的肿瘤性疾病。MDV是研究病毒性肿瘤病特别是疱疹病毒肿瘤的理想实验模型。Gp96免疫原性的研究进展为MDV的研究提供了新的思路。但作为哺乳动物gp96同系物的鸡的热应激蛋白hsp108的研究一直集中在它作为一种转铁蛋白受体的方面。因此，深入研究鸡的hsp108具有很重要的意义。 本实验通过RT-PCR技术克隆了不同品系的健康鸡肝脏hsp108基因(包括SPF鸡，三黄鸡和乌鸡)，并推导出相应的氨基酸序列；同时还克隆了MDV感染引发的SPF鸡肿瘤肝脏hsp108基因以及中国人肝癌细胞gp96基因。通过软件对这些基因的多态性进行了分析。发现，来自不同品系鸡肝脏组织的hsp108基因在核苷酸上存在一些微 伞燕：鸡热应激炎山HS卜！08特性‘。功能初步个·阶弱变化，但氨基酸没有任何差异；与已发表的来自鸡输卵管的115 plo 8基因比较，发观有一个氨基酸不同；说明不同器官之间hSP108基因有可能存在差异；来自正常鸡肝脏组织及肿瘤肝脏组织的h叩108基因之间，仅发现一个核菩酸变异，但氨基酸未发现差异，而中国人肝癌细胞的PP96同正常相比则出现两个氨基酸变异，推测癌化或病毒感染时gP96存在变异的趋势。 热应激蛋白家族的成员PP96具有排斥肿瘤及传染性疾病的的免疫原性。近年来对哺乳动物 gP96的免疫机制和作为治疗疫苗的优越性进行了详细深入的研究，为肿瘤和传染性疾病的预防及治疗提供了新的思路。为进一步探讨 hSPI 08的免疫作用，我们对鸡hSP108的提取及纯化方法进行了摸索，最终通过超速离。U，硫氨沉淀，亲和层析，及离子交换等步骤成功地从鸡肝脏中纯化出人 gp96的同系物 hspl 08蛋白，纯度在95％以上。纯化的鸡肝脏组织hsp108能够与鼠anti－NgP96单克隆抗体结合，说明鸡的 hs PI 08同人的卯％具有类似的功能区。通过酸释放法可以得到其结合的多肽。通过对该蛋白性质的一系列研究发现，应激情况下，如mV感染后引发肝脏肿瘤，从鸡肝脏中提取的 hspl08较正常组织中该种蛋白含量增高将近 4倍。此外，用 MDV多克隆血清与纯化的 hsp108蛋白相互作用，然后用 HRP标记的鸡 IgY二抗识别，根据结果椎坝IJ，／A MDV感染引发白勺肿瘤肝脏组织中提取白勺 hsp108结合有mV抗原肽，说明鸡的hsp108很可能具有同哺乳动物gp96类似的抗原呈递作用。为下一步分离MDV抗原肽及自体免疫实验的可行性奠定了理论基础。 从肿瘤细胞或病毒感染的细胞中提取到的热应激蛋白（HSPS）己经被证明能够引发肿瘤特异性或病毒特异性免疫反应。该提取物的免疫原性归功于与HSPS结合的抗原多肽。研究证明具有免疫原性的HSP－多肽复合物也可以在体外进行组装。这些结果为设计新型的m疫苗提供了新的思路。本实验通过盯－PCR的方法从鸡肝脏组织中得到hsp108基因。将其分另IJ克隆到pGEX－6p－IkpET30a（＋）表达载体中进行融合及非融合表达。分u使用 Glutathione Sepharose” 4B Chelating Sepharose” Fast Flow填料进行亲和层析得到纯化的蛋白，两种蛋白均能够被鼠源的人PP96单抗识别。选择荧光素标记的来自朋V核。G抗原第88－96位的9肤（YVNTNMCLK）进行结合实验，发现融合及非融合重组蛋白都能够与该抗原肽特异性结合，其中非融合蛋白与肽的结合力稍强，BSA也能与抗原肽非特异性结合，但结合力极弱，应该属非特异性吸附。以上实验结果为进一步研究鸡hspl08－多肽复合物的免疫原性及作为疫苗的新策