研究背景:　　 鼻咽癌(nasopharyngealcarcinoma，NPC)是发生于鼻咽粘膜的恶性肿瘤，好发于中国华南地区，每100，000人大约有25-50人发病。鼻咽癌的发病同EBV病毒感染，遗传易感性以及接触某些化学致癌物有关。在过去的几十年里，鼻咽癌的诊断和治疗手段逐步提高，但Ⅳ期鼻咽癌5年生存率仅有30％，局部复发和远处转移导致预后不良。　　 当前越来越多的证据显示肿瘤起源于肿瘤干细胞(cancerstemcells，CSCs)，它是一类未分化细胞，具有自我更新、无限增殖和分化的能力，能促使肿瘤组织形成和无限生长，CSCs往往对化疗抵抗并导致肿瘤转移和复发。因此，杀伤肿瘤干细胞对于成功治疗肿瘤至关重要。　　 目前分离和鉴定肿瘤干细胞主要有如下几种方式:1.特异性细胞表面标记，细胞表面蛋白如CD24、CD44、CD133和一些胚胎干细胞标记物也广泛应用于鉴定肿瘤干细胞;2.侧群细胞，利用DNA染料Hoechst33342染料和流式细胞术分选，它们依赖ABCG2分子的表达将DNA特异性染料Hoechst33342泵出细胞外，目前已有报道表明SP可应用于鉴别和分选鼻咽癌肿瘤干细胞;3.肿瘤球培养，含EGF、bFGF无血清培养基可以促进正常干细胞的体外扩增而不发生分化，通过无血清培养基培养形成肿瘤细胞球可以用来富集肿瘤干细胞;4.PKH26标记，一种亲脂性的红色荧光染料，可与细胞膜的脂质双分子层不可逆结合，已有报道PKH26可标记静止期细胞，可作为肿瘤干细胞标记，PKH26阳性细胞具有肿瘤干细胞性质;5.乙醛脱氢酶(ALDH)，已经被报道可用作为肿瘤干细胞的标记物，乙醛脱氢酶催化乙醛氧化成羧酸，在生物体内外的代谢中扮演着重要角色，已有报道称ALDH可作为多种肿瘤的干细胞标记物。　　 目前已有许多研究表明肿瘤的复发和转移同肿瘤干细胞密切相关，传统的化疗药物只能杀伤非干细胞，肿瘤干细胞假说为超越传统抗增殖药物的治疗策略的合理性奠定理论基础。当前抑制肿瘤干细胞的策略主要包括:1.阻断自我更新信号通路;2.逆转其多药耐药性;3.诱导肿瘤细胞分化;4.影响调节干细胞的microRAN表达。有报道将EMT，肿瘤干细胞和肿瘤耐药三者比喻为肿瘤发生过程中的邪恶轴心(axisofevil)，三者可互相转化，microRNA在调节三者之间关系中发挥着最重要的作用。　　 长期以来，人们一直期望能找到一种能特异性地抑制CSCs的药物。但是由于CSCs在肿瘤细胞群中分布之稀少，以及体外培养时的不稳定性，使得寻找这样一种药物的目标远不可及。当前的观点认为普通化疗药物只能杀伤占肿瘤绝大部分的非肿瘤干细胞，而难以杀伤肿瘤干细胞，只有联合使用特异性针对肿瘤干细胞的药物才有望彻底消除肿瘤。　　 盐霉素是一种羧酸聚醚类抗生素，主要用于防止白色链霉菌引起的鸡球虫病，当前有报道称盐霉素具有抑制肿瘤干细胞作用，盐霉素抑制乳腺癌干细胞的效力比普通抗癌药物泰克索高100倍。　　 本研究以常规化疗药物顺铂作为对照，研究了盐霉素对鼻咽癌肿瘤干细胞的作用。通过侧群分析，Aldefluor检测以及肿瘤球形成实验证明了盐霉素可以有效抑制鼻咽癌肿瘤干细胞。此外，证实了盐霉素可通过调节miRNA-200c发挥其抑制肿瘤干细胞的作用。本研究为盐霉素抑制肿瘤干细胞的作用机制提供了重要的结论。　　 研究目的:　　 1.验证鼻咽癌肿瘤球干细胞特性;　　 2.检测盐霉素抗鼻咽癌肿瘤干细胞效应;　　 3.研究盐霉素抗肿瘤干细胞分子机制。　　 方法:　　 细胞和培养条件:　　 本实验所用细胞均由本实验室保存。人鼻咽癌细胞株培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养基，青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，于37℃、5％CO2培养箱内培养。　　 肿瘤球培养和分化实验:　　 无血清培养基配制:无血清培养基(serumfreemedium，SFM)由Ham’sDMEM-F12(1:1)、B27(1:50)、EGF(20ng/ml)、bFGF(20ng/ml)组成，将鼻咽癌SUNE-1，5-8F细胞接种于10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，待细胞处于对数生长期，用PBS液清洗，胰酶消化，消化后再用PBS清洗两次，置于低粘附培养板中，悬浮于SFM中进行传代培养，观察细胞在SFM中形成肿瘤干细胞球的过程，将于SFM中形成的细胞球重新置于SSM中诱导其分化，48h后倒置显微镜观察细胞形态变化。　　 免疫荧光:　　 吸取SFM中形成的肿瘤球至24孔板中（肿瘤球样品），或吸取SFM中形成的肿瘤球植入预先放有盖玻片的6孔板中（肿瘤球分化样品），4％多聚甲醛固定，PBS清洗，0.2％TritonX-100破膜，PBS清洗，加入一抗37℃孵育45min，PBS清洗，洗涤后加入荧光二抗，37℃孵育45min，PBS清洗，DAPI染细胞核，在共聚焦显微镜下观察。10×KB配方:0.1MTris，pH7.5;1.5MNaCl;1.0％BSA。　　 MTT检测:　　 过滤网将大于40μm的肿瘤球分离出来分离成单个细胞或将对数生长期的贴壁细胞分别接种到96孔板中，每孔2000个细胞，37℃，5％CO2培养箱中培养6h，依浓度梯度加入药物。药物作用完毕后每孔加20μlMTT，继续培养4～5h，将细胞培养液上清弃去，每孔加入200μlDMSO，摇床混匀约5min。酶标仪490nm比色，绘制肿瘤细胞生长曲线。　　 侧群细胞检测:　　 将贴壁细胞或肿瘤细胞分离成单个细胞，离心后用PBS清洗，含2％胎牛血清的1640培基重悬，用Hoechst33342标记，标记的细胞在37℃孵育90min，PBS洗涤，重悬，检测前加入PropidiumIodide标记死细胞，采用流式细胞仪检测侧群比例。　　 Aldefluor检测:　　 将贴壁细胞或肿瘤细胞分离成单个细胞，将细胞悬浮于反应缓冲液中，调整细胞浓度为1×106/mL，测定管中细胞悬液总体积1mL，向测定管中加入激活ALDH的底物溶液，对照管中加入ALDH特定抑制物DEAB溶液，取出测定管中500μL细胞悬液加入对照管中，混匀，将测定管和对照管置于37℃孵育40min.离心洗涤后PBS重悬，采用流式细胞仪检测。　　 免疫印迹检测:　　 蛋白质在SDS-PAGE凝胶上进行分析，将分离的蛋白转至PVDF膜上，PVDF膜浸泡在封闭液中25℃2h，一抗4℃孵育过夜，PVDF膜与二抗在室温下孵育1h，采用化学发光法检测。　　 细胞转染:　　 细胞接种在6孔板内，待50％细胞汇合后，用Opti-MEM培养基稀释Lipofectamine2000转染试剂，并在室温孵育10min，在Opti-MEM培养基中稀释miR-200c抑制物及阴性对照，混合稀释的miR-200c抑制物/NC和稀释的Lipofectamine2000转染试剂，室温孵育10min，将混合物加入培养基中，置于37℃，5％CO2孵箱中培养。　　 RNA提取:　　 细胞总RNA提取:细胞消化，离心，弃上清，加入1mlTrizol;室温孵育15min，裂解细胞;4℃，12000rpm离心15min，取上清;每1mlTrizol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，冰上孵育15min;4℃，12000rpm离心15min，缓慢取上清，避免吸入中间层的白色物质，上层水相体积约为所用Trizol试剂的60％;将吸取的上清置于另一干净EP管内，加入等体积的异丙醇沉淀水样中的RNA，颠倒混匀，4℃，12000rpm离心15min，见RNA沉淀附着于EP管底和侧壁;弃上清，用预冷的75％乙醇(1％DEPC水配制)1ml悬浮洗涤沉淀;4℃，7500g离心5min，干燥RNA，用DEPC水溶解沉淀，-80℃保存。　　 免疫组织化学:　　 石蜡切片经脱蜡，乙醇梯度水化，抗原修复，灭活内源性过氧化物酶，一抗4℃孵育过夜，二抗25℃孵育10min，DAB显色，显微镜观察显色，苏木素复染核，盐酸乙醇分化，脱水，透明。　　 体内成瘤实验::　　 接种时细胞用100μl按1:1DMEM和Matrigel悬浮，观察其成瘤情况如下，记录小鼠肿瘤发生的时间;根据公式V=1/2ab2（a为长径，b为短径）计算肿瘤体积，绘制肿瘤成长曲线，肿瘤生长数周后处死动物取出肿瘤组织。　　 本课题所用统计学方法:　　 采用统计软件SPSS13.0对实验结果进行统计学处理和分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示。两组肿瘤体积比较采用两独立样本T检验;肿瘤球形成及直径，ALDH阳性细胞和侧群比例，凋亡检测，动物成瘤时间以及原代细胞肿瘤球数量数据均采用单因素方差分析（One-wayANOVA）比较各组差异，如方差齐性，多重比较采用LSD法;如方差不齐，采用Welch值，多重比较采用DunnettT3法;在体肿瘤生长曲线的比较采用两因素方差分析(two-wayANOVA)比较各组间差异。P＜0.05被认为有统计学差异。　　 结果:　　 1.培养和鉴定鼻咽癌肿瘤球　　 (1)免疫荧光和westernblot检测结果显示肿瘤球高表达干细胞标记物Oct3/4，Bmi-1，Nanog，Sox2，EpCAM和间充质标记物vimentin，低表达上皮标记物CK5/6;肿瘤球分化后高表达CK5/6;　　 (2)单个PKH26阳性的细胞可形成肿瘤球，PKH26阳性细胞可代表肿瘤干细胞;免疫荧光结果显示肿瘤球有少量细胞同时表达PKH26和干细胞标记So×2，CD133和ABCG2;　　 (3)肿瘤球细胞(18.1％，31.9％)ALDH+细胞比例较分化细胞(1.0％，1.6％)增高;肿瘤球细胞(6.1％)SP细胞比例较分化细胞(2.3％)增高;　　 (4)肿瘤球细胞较分化细胞增殖速度快;肿瘤球细胞耐药性(cisplatin)较分化细胞强（IC50＞5倍）;　　 (5)肿瘤球细胞成瘤能力较分化细胞强，1×104个肿瘤球细胞接种3只裸鼠，2只成瘤，1×104个分化细胞接种裸鼠无肿瘤形成。　　 2.Salinomycin抑制鼻咽癌肿瘤干细胞的作用　　 (1)Salinomycin处理组较未处理组和cisplatin处理组肿瘤球形成率低(P=0.000)，肿瘤球体积小(P=0.000);　　 (2)肿瘤球细胞对salinomycin较cisplatin敏感（IC50＞5倍），分化细胞对salinomycin和cisplatin敏感性无明显差异;　　 (3)Cisplatin处理组可增加细胞SP比例，salinomycin处理组可降低细胞SP比例;salinomycin抑制肿瘤球ALDH阳性细胞比例（2μM，P=0.005;5μM，P=0.003），cisplatin无抑制作用(P=0.421);　　 (4)Salinomycin处理细胞后c-myc，Oct3/4，Nanog蛋白表达降低;　　 (5)Salinomycin抑制体内肿瘤生长较cisplatin作用显著(P=0.000);salinomycin较cisplatin可显著推迟肿瘤形成时间(P=0.011);　　 (6)Salinomycin治疗组原代细胞较cisplatin治疗组SP比例低(0.9％vs.2.1％)，ALDH阳性细胞比例较低(0.9％vs.8.6％)，成球率低(P=0.000);　　 (7)Salinomycin治疗组动物成瘤组织坏死明显;Salinomycin治疗组高表达E-cadherin，低表达vimentin和Oct3/4。　　 3.Salinomycin选择性抑制肿瘤干细胞分子机制研究　　 (1)Salinomycin处理组细胞表达E-cadherin较高，vimentin，SUZ12和Slug较低;　　 (2)相对于CNE-2细胞，C-666和6-10B细胞表达较高ABCG2，相应地，C666和6-10B细胞对salinomycin较CNE-2细胞敏感;Salinomycin可抑制ABCG2和p-glycoprotein的表达;　　 (3)Salinomycin可抑制β-catenin，cyclinD1和P-AKT表达;　　 (4)随着salinomycin浓度增加，细胞凋亡比例逐渐增加(P＜0.05)。　　 4.Salinomycin通过调节miR-200c抑制肿瘤干细胞　　 (1)Salinomycin处理细胞后提高了miR-200c（＞10倍）;　　 (2)miR-200c-inhibitor可提高细胞SP比例和肿瘤球形成能力，miR200c-inhibitor可拮抗salinomycin抑制SP的作用(P=0.013)和抑制肿瘤球形成的能力(P=0.001);　　 (3)miR-200c-inhibitor可降低细胞对cisplatin的敏感性，可增加对salinomycin的敏感性;　　 (4)细胞经miR-200c-inhibitor处理可增加干细胞标记物SUZ12和Bmi-1表达，联合salinomycin处理可拮抗miR-200c-inhibitor作用。　　 结论:　　 1.鼻咽癌肿瘤球细胞具有干细胞特性，表达干细胞标记物并具有高致瘤性;　　 2.Salinomycin可选择性抑制鼻咽癌肿瘤干细胞，主要通过抑制EMT发生，抑制Wnt/β-catenin通路，下调多药耐药基因发挥作用;　　 3.Salinomycin可通过上调miR-200c抑制靶蛋白进而抑制肿瘤干细胞。