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目的:衰老是导致肌肉减少症的原因之一,这导致衰老过程中出现生理和认知恶化,加剧其他潜在疾病并最终导致患者预期寿命下降。衰老可能通过慢性低度炎症刺激,诱导骨骼肌中的成纤维细胞衰老,并由此影响肌肉减少症的进展。转化生长因子β（transforming growth factorβ,TGF-β）信号通路在肌肉发育、适应和疾病中有多效性作用。TGF-β1在衰老条件下的升高,通过阻断肌肉再生和诱导人及小鼠肌肉组织纤维化而导致肌肉萎缩。自噬是一种保守的细胞内降解过程,它将蛋白质和细胞器等大分子物质包裹并运送到溶酶体中进行后续降解。在衰老过程中,过度和缺陷的自噬都与骨骼肌的丧失高度相关,基础自噬的缺失会导致错误折叠蛋白的异常聚集,而过度的自噬也会引起细胞应激,导致蛋白降解增加导致骨骼肌的损失。泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin–proteasome system,UPS）是最著名的细胞蛋白水解系统,负责降解大多数错误折叠或缺陷的细胞蛋白。肌肉特异性E3泛素连接酶肌肉环指1（muscle RING fnger 1,Mu RF1）和肌萎缩F盒（muscle atrophy F-Box,MAFbx）参与骨骼肌蛋白降解的调控,它们的表达在骨骼肌萎缩中显著增加。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin,m TOR）复合物1（m TOR complex 1,m TORC1）,是细胞生长和代谢的基本调控因子之一,其主要作用是整合生长因子、氨基酸、氧气和能量的可用性,促进蛋白质、脂类和核苷酸的生物合成,其关键功能之一是通过p70核糖体蛋白S6激酶（P70 ribosomal protein S6 kinase,p70S6K）和核糖体相关的4E结合蛋白1（4E binding protein 1,4EBP1）等蛋白的磷酸化促进核糖体的生物发生来驱动蛋白质翻译。此外,m TORC1的另一个主要作用是抑制自噬。m TORC1的遗传或药理学抑制是迄今为止最有效的延迟年龄相关病理生理变化的干预措施。m TORC1抑制通过减少蛋白毒性和氧化应激的积累引起m RNA翻译普遍减少减缓衰老。研究表明,m TORC1在肌肉减少症肌肉中过度活化,部分抑制m TORC1通路可以抵消肌肉减少症。本研究通过衰老小鼠模拟肌肉减少症模型,通过H2O2诱导人胚胎肺成纤维WI-38细胞衰老,用衰老成纤维细胞条件培养基培养小鼠成肌C2C12细胞,探究衰老成纤维细胞是否通过分泌TGF-β影响肌肉减少症小鼠骨骼肌萎缩。此外,本研究还探究了肌肉减少症对小鼠骨骼肌泛素-蛋白酶体系统及自噬的影响,并探究TGF-β、泛素-蛋白酶体系统及自噬在肌肉减少症中关系及m TORC1通路在其中的作用。研究方法:选取不同月龄的C57BL/6J小鼠,分成青年组（YC组,6-8周龄）、中年组（MC组,8月龄）以及老年组（OC组,20月龄）。测定小鼠腓肠肌指数（gastrocnemius muscle mass index,GMI）、腓肠肌质量（gastrocnemius muscle mass,GMM）、抓力及相对抓力,苏木素-伊红（hematoxylin-eosin）染色观察骨骼肌萎缩性改变,天狼星红染色观察骨骼肌纤维化改变。Western blot和RT-q PCR检测小鼠骨骼肌内自噬相关因子微管相关蛋白1轻链3（microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3B）、P62、Beclin 1、泛素-蛋白酶体系统相关因子Atrogin-1和肌肉环指1（muscle RING fnger 1,Mu RF1）及m TORC1通路蛋白的表达。过氧化氢（hydrogen peroxide,H2O2）诱导胚胎肺成纤维WI-38细胞衰老,Western blot及RT-q PCR检测细胞衰老相关因子p16、p21和p53表达,流式细胞术检测细胞周期,ELISA检测细胞TGF-β分泌。诱导小鼠成肌C2C12细胞肌管分化,TGF-β或衰老WI-38细胞条件培养基培养C2C12细胞,Western blot和RTq PCR检测C2C12细胞自噬相关因子LC3B、P62、Beclin 1表达,Western blot检测萎缩相关蛋白肌球蛋白重链（myosin heavy chain,MHC）、Atrogin-1、Mu RF1及m TORC1通路蛋白表达,给予TGF-β阻断剂,Western blot和RT-q PCR检测C2C12细胞MHC、Atrogin-1、Mu RF1、内直肌生肌因子5（myogenic 5,Myf5）、成肌分化因子（myogenic differentiation protein,Myo D）表达。给予自噬激活剂,Western blot和RT-q PCR检测泛素-蛋白酶体系统相关因子Atrogin-1和Mu RF1表达,Western blot检测萎缩相关蛋白MHC、Atrogin-1、Mu RF1蛋白表达。给予m TORC1通路抑制剂雷帕霉素,Western blot和RT-q PCR检测C2C12细胞自噬相关因子LC3B、P62、Beclin 1和泛素-蛋白酶体系统相关因子Atrogin-1和Mu RF1表达,Western blot检测萎缩相关蛋白MHC、Atrogin-1、Mu RF1表达。结果:1、随着年龄增长,小鼠前肢抓力下降,骨骼肌体积减轻,骨骼肌萎缩及纤维化加重,H2O2诱导WI-38细胞p16、p21、p53蛋白和m RNA表达水平均增加,处于G1期细胞比例上升,TGF-β分泌增加,经衰老成纤维细胞条件培养基以及不同浓度TGF-β处理后的肌管细胞内肌球蛋白重链MHC表达降低,肌萎缩基因Atrogin-1和Mu RF1蛋白表达升高,TGF-β阻断剂ITD-1处理降低肌管细胞Atrogin-1和Mu RF1表达,增加MHC表达。2、随着年龄增长,小鼠骨骼肌LC3II/LC3I比值和Beclin 1表达降低,P62表达升高,Atrogin-1和Mu RF1表达升高。随着TGF-β剂量增高,成肌细胞LC3B II/LC3B I比值和Beclin 1表达降低,P62表达升高,MHC、Myf5和Myo D表达减少。TGF-β刺激增加成肌细胞Atrogin-1和Mu RF1表达,自噬激活剂下调成肌细胞Atrogin-1和Mu RF1的表达,增加细胞MHC、Myf5和Myo D表达。3、随着年龄增加,小鼠骨骼肌m TORC1下游信号p-rp S6和p-S6K1蛋白表达显著增加,p-4EBP1蛋白的表达显著降低。TGF-β刺激增加C2C12细胞p-rp S6和p-S6K1表达,降低p-4EBP1表达,m TORC1抑制剂雷帕霉素增加C2C12细胞LC3II/LC3I和Beclin-1表达,降低细胞P62表达,降低细胞Atrogin-1和Mu RF1表达增加细胞MHC、Myf5和Myo D表达增加。结论:衰老成纤维细胞分泌TGF-β通过激活m TORC1信号通路抑制骨骼肌细胞自噬,增加蛋白酶体活性,从而促进骨骼肌萎缩。