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近十年来,随着老龄化进程的加剧和居民生活方式的改变,中国人群高血压的患病率一直居高不下,且呈持续上升的趋势。调查表明,目前全球约有近11亿高血压患者,其中中国约有2.9亿。庞大的患病人群使高血压成为危害国民健康的重要公共卫生问题。高血压是一种最常见的慢性疾病,其病因复杂,包括遗传和环境等多种因素。本文通过筛查原发性高血压人群的线粒体全基因组,发现一个携带线粒体tRNAMet 4435A>G突变的原发性高血压家系,具有典型的母系遗传特征,这表明线粒体基因组在高血压的发生和遗传过程中发挥作用。因此我们利用分子及生化功能等实验,研究其对线粒体功能的影响,探讨m.4435A>G突变与原发性高血压的相关性。 目的: 通过构建携带m.4435A>G突变的血小板融合细胞系,利用分子及生化功能实验分析,探讨m.4435A>G突变与原发性高血压的相关性,对原发性高血压相关的m.4435A>G突变的分子致病机制进行研究。初步探讨m.4435A>G突变与原发性高血压的病理生理学机制。 方法: 通过筛查原发性高血压人群的线粒体全基因组,我们发现一个携带m.4435A>G突变的原发性高血压家系,母系成员外显率为47.1%。运用PEG诱导法将受试者的血小板与mtDNA缺失的ρ0206 细胞融合,构建核背景一致的血小板融合细胞系并进行鉴定。同时通过体外合成突变型及野生型的tRNAMet,检测其稳定性变化。用构建成功的血小板融合细胞系进行一系列分子及生化功能研究,包括tRNAMet引物延伸实验、tRNA构象变化、稳态及氨酰化水平检测、线粒体蛋白翻译水平、ATP产量、细胞内ROS活性氧、膜电位变化、细胞氧耗速率检测及线粒体呼吸链复合体酶活性检测。 结果: 对先证者及家系所有母系成员的线粒体基因组进行测序分析,发现母系成员均携带线粒体tRNAMet 4435A>G突变,且都为G2a1线粒体单体型。用成功构建的血小板融合细胞系进行实验,结果显示在突变组均检测到线粒体tRNAMet 的m1G37修饰;在非变性条件下,突变组tRNAMet的电泳迁移速率明显快于野生型tRNAMet,并且两者的Tm值相差约2.5℃,同时突变组tRNAMet氨酰化水平平均降低约27.5%。Northern blot结果显示,突变组tRNAMet的稳态水平平均下降约28.52%。在本研究中突变组线粒编码的ND3、ND4、CYTB、CO2、ATP6均出现不同程度的降低,这些多肽所在的呼吸链复合体I、III、IV、V的酶活性也相应下降,同时细胞的氧耗速率也受到影响。此外,突变组线粒体膜电位平均下降约36.5%,细胞ATP产量平均降低30.2%,细胞活性氧产量平均增加47.5%。 结论: m.4435A>G突变产生了tRNAMet的m1G37修饰,引起线粒体tRNAMet结构和稳定性发生改变,导致稳态水平和氨酰化水平下降,引起tRNAMet代谢异常,导致线粒体编码的多肽合成水平下降,线粒体呼吸链复合体酶活性降低,进而损害线粒体及细胞功能,引起细胞氧耗速率降低,线粒体膜电位降低,ATP合成减少,从而导致ROS产生增加,这一系列的线粒体功能障碍参与了原发性高血压表型的发生。