研究背景 肺动脉高压是左向右分流先天性心脏病(Congenital heart disease,CHD)常见并且危害性较大的并发症,对其发病机理的研究是目前的热点问题,但确切机理仍不十分清楚,有必要对其发病机理进行进一步探讨。1973年,瑞士日内瓦第一次WHO肺高压会议将肺动脉高压(Pulmonary artery hypertension,PAH)定义为在海平面、静息状态下肺动脉平均压大于或等于25mmHg,和/或肺动脉收缩压大于30mmHg,或者运动状态下肺动脉平均压大于30mmHg。2008年,美国加州戴纳伯恩特WHO第四次肺高压会重新定义为静息状态下,肺动脉平均压大于或等于25mmHg,则认为存在肺动脉高压[1]。2013年,法国尼斯WHO第五次肺高压会议将肺动脉高压定义为肺血管重塑是肺血管功能紊乱导致的肺动脉高压发展为不可逆的标志,肺动脉平滑肌细胞(Pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)的增殖和迁移是肺血管重塑中病理生理改变的中心环节[2]。PAH发病率逐年升高,随病情进展肺内血管的阻力和压力逐渐升高,最终导致右心衰竭的病理生理改变,从而引起一系列的临床症状,甚至死亡。内皮素-1(Endothelin-1,ET-1)是调节心血管系统功能的重要因子,由21个氨基酸分子构成的血管活性多肽,是最强的血管收缩调节因子之一,同时也是一种促有丝分裂原,许多细胞可以分泌ET-1,其中血管内皮细胞是主要的来源。研究表明在肺动脉高压动物模型和病人血浆及肺组织ET-1产生增加,ET-1与其特异性受体结合介导血管收缩或舒张,促进或抑制血管平滑肌细胞的增殖能力和迁移能力[3,4]。ET-1有两种主要受体即内皮素受体A(Endothelin A receptor,ETAR)和内皮素受体 B(Endothelin B receptor,ETBR),在心血管系统,血管平滑肌细胞的表面主要存在ETA和少量ETB受体,而血管内皮细胞的表面主要存在ETB受体。ET-1结合PASMCs膜上的ETA受体后,可以促使PASMCs增殖、迁移,而与血管内皮细胞上的ETB受体结合,可以减少血循环中的ET-1,从而间接地使血管舒张、抑制PASMCs的增殖[4]。波生坦(Bosentan,BST)是一种具有双重作用的内皮素受体拮抗剂,它可竞争性的与PASMCs表而的ETA或ETB受体特异性结合,从而阻止ET-1强效的引起血管异常收缩、促PASMCs增殖和迁移的能力,降低肺动脉压力和肺血管阻力,从而改善右心室功能。波生坦是第一个获得批准靶向治疗PAH的内皮素受体拮抗剂药物,通过随机、双盲、多中心的临床系列研究证实,在治疗儿童期的PAH,安全有效,可以明显缓解PAH症状,改善运动耐力,及阻止病情进展[5,6]。目前波生坦对小年龄段婴儿先天性心脏病合并PAH的诊疗经验报道不多,因此对于这些小年龄段的儿童口服波生坦的疗效及可能的副作用值得进一步的研究。MicroRNAs(miRNAs),作为一种内源性、非编码小分子RNA,由大约20～24个核苷酸组成,可通过与编码蛋白质的基因的特异性结合,影响了mRNA的剪切或者引起mRNA的直接分解,减弱了蛋白质的翻译水平,发挥基因调节作用[7]。2010年一项对于PAH病人肺动脉内皮细胞和PASMCs的研究,证实了在这两种细胞中存在基因组不稳定现象。这对人们研究基因组调控功能失调在肺血管重塑中作用提供了理论依据。目前已证实miRNAs在心血管疾病发生中发挥关键的基因调控作用[8],应用TargetScan软件对miRNAs靶基因分析发现几十种miRNAs与PAH发病有关。MiRNAs作为上游调控分子,在PAH的形成与发展过程起了一定的作用[9]。近年研究证实microRNA-27a(miR-27a)在缺氧性PAH的动物模型肺组织表达上调,抑制miR-27a表达可减轻肺动脉内皮细胞异常增殖和肺高压产生[10]。但miR-27a对体外培养的人PASMCs增殖方面的报道,h2前尚未见。过氧化物酶体增殖物激活受体(Peroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ),属核转录因子,可以通过与其配体结合后被激活,分3种不同的亚型,分别为PPARα、PPARδ和PPARγ,各个亚型在细胞的生长分化、凋亡方面,抗炎性能力以及在一些代谢性疾病中起了至关重要的影响。PPARγ在血管平滑肌细胞及心肌细胞高表达,与其配体结合后,调节基因转录[11],研究发现PPARy参与了缺氧性肺动脉高压大鼠PAH的形成,PPARγ配体罗格列酮(Rosiglitazone,RSG)可延缓缺氧性肺动脉高压的形成、增强PPARγ的表达[12,13]。但PPARγ或其配体在左向右分流型PAH中的变化及作用尚未见报道,同时波生坦对左向右分流肺动脉高压miR-27a/PPARγ/ET-1信号通路的影响亦尚未见报道,为此,本实验进行了以下研究:第一部分 波生坦治疗肺动脉高压的上游分子调控机制的研究目的通过对体外培养的人PASMCs进行干预,研究波生坦对培养的人PASMCs内皮素受体、miR-27a和PPARγγ的影响及其信号转导机制,同时探讨miR-27a在PAH的形成和发展过程中的影响。方法1、波生坦对PASMCs增殖的影响:选择人肺动脉平滑肌细胞株(第3-7代),将PASMCs接种于96孔板上继续培养24h,然后将培养细胞分3组,每组6孔:①ET-1组:每孔内加入0.1μM ET-1;②波生坦组(ET-1+BST):每孔内加入0.1μM ET-1+50μM波生坦;③每孔内加入等量PBS作为对照组。继续培养24h。采用CCK8法及BrdU掺入实验测定细胞增殖能力。2、波生坦对PASMCs内皮素受体、miR-27a及PPARγ表达的影响:采用上述培养的3组PASMCs,实时荧光定量RT-PCR测定细胞ETAR、ETBR的mRNA水平及miR-27a表达水平;Western blot测定ETAR、ETBR及PPARγ蛋白表达。3、MiR-27a过表达及受抑制时对PASMCs增殖、内皮素受体和PPARy表达的影响:体外培养的人PASMCs,外源性应用ET-1(0.1 μM)干预24h后,利用脂质体 Lipofectarnine 2000 转染 miR-27a mimics(mimics 组)、miR-27a inhibitors(inhibitor组)以及阴性对照(miR-27a mimics NC和miR-27a inhibitor NC)。将转染的 miR-27a mimics或miR-27a inhibitors的PASMCs分别分为两组,其中一组分别加入50μnM波生坦干预(BST+mimics组和BST+inhibitor组),以未转染组为mock组,每孔加等量PBS,继续培养48h后,实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测miR-27a过表达及抑制对内皮素受体和PPARγ表达的影响。4、PPARγ抑制剂及配体对PASMCs内皮素受体和miR-27a表达的影响:将体外培养的人PASMCs,外源性ET-1(0.1μM)干预24h后,研究PPARy抑制剂 GW9662 的影响时,在 GW9662 组,加入 1μM GW9662;GW9662+BST组,加入1μM GW9662及500μM波生坦。研究PPARγγ配体罗格列酮的影响时,罗格列酮组(RSG组),加入10μM罗格列酮;RSG+BST组,加入10μM罗格列酮及50μμM波生坦。对照组均加入等量PBS。继续培养48h后,实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测PPARy对PASMCs内皮素受体及miR-27a表达的影响。结果1、CCK8法和BrdU掺入实验结果显示:外源性给予ET-1后,细胞发生明显增殖,与对照组相比,OD值的比较为(1.29±0.09)vs(1.04±0.04),P<0.05;BrdU标记阳性细胞数(%)比较为(59.71±2.52)vs(19.5 0±1.79),P<0.01。而再加入波生坦后,细胞增殖减缓,与ET-1组比较,OD值比较为(1.05±0.06)vs(1.29±0.09),P<0.05;BrdU标记阳性细胞数(%)比较为(26.83±1.38)vs(59.71±2.52),P<0.01。2、ET-1组,ETAR、ETBR的mRNA表达和miR-27a的表达水平与对照组比,均明显升高(P<0.01);ET-1+BST组ETAR、ETBR的mRNA表达和miR-27a的表达低于ET-1组(P<0.01)。与对照组相比,ET-1组,ETAR、ETBR的蛋白的表达增加(P<0.01),而PPARγ蛋白表达减少(P<0.01)。ET-1+BST组ETAR、ETBR的蛋白水平低于ET-1组(P值分别<0.01,<0.05),而PPARy蛋白表达高于ET-1组(P<0.01)。3、转染miR-27a mimics后,mimics组 ETAR、ETBR的mRNA和蛋白表达水平均明显高于mock组(P<0.01);PPARγ蛋白的表达明显低于mock组(P<0.01)。而BST+mimics组,ETAR、ETBR的mRNA和蛋白表达水平均明显下降,低于mimics组(P<0.01),PPARy蛋白的表达明显高于mimics组(P<0.01)。而转染miR-27a inhibitors后,inhibitor组ETAR及ETBR的mRNA和蛋白表达水平均明显低于mock组(P<0.01),PPARy蛋白的表达明显高于mock组(P<0.01)。而BST+inhibitor组,ETAR、ETBR的mRNA和蛋白表达水平亦明显下降,均低于inhibitor组(P<0.05),PPARy蛋白的表达高于inhibitor组(P<0.05))。MiR-27a mimics NC和miR-27a inhibitor NC对ETAR、ETBR的mRNA及蛋白水平和PPARγ蛋白的表达影响不明显(P>0.05)。4、应用PPARy抑制剂GW9662后,ETAR、ETBR的mRNA及蛋白水平的表达明显高于对照组(P<0.01),同时也发现miR-27a的表达明显高于对照组(P<0.01);GW9662+BST组,ETAR、ETBR的mRNA及蛋白水平的表达明显下降,低于GW9662组(P<0.01),miR-27a的表达明显低于GW9662组(P<0.01);应用PPARy配体罗格列酮处理后,培养细胞的ETAR、ETBR的mRNA及蛋白水平低于对照组(P<0.05),同时也发现miR-27a表达减少(P<0.05);RSG+BST组,ETAR、ETBR的mRNA及蛋白水平下降较明显,均低于RSG组(P<0.01),同时发现miR-27a表达低于RSG组(P<0.05)。结论1、波生坦通过拮抗ET-1的作用,进而影响miR-27a/PPARγ/ET-1信号途径而延缓PASMCs增殖。2、MiR-27a与PPARy交互抑制,进而调节ET-1促PASMCs增殖,提示miR-27a/PPARγ可能是ET-1信号途径的上游调控分子。第二部分波生坦对左向右分流先天性心脏病合并肺动脉高压患儿ET-1、miR-27a及PPARγ表达影响目的通过对临床资料的收集,研究波生坦对左向右分流先天性心脏病合并PAH患儿血浆ET-1含量、miR-27a及PPARy的表达的影响。方法1、病例选择及用药:选择30例年龄3月～14岁的左向右分流先天性心脏病合并PAH患儿,超声心动图测定肺动脉收缩压≥60mmHg,肺动脉平均压≥45mmHg者入组(肺高压组),入组后口服波生坦2mg/kg,每日2次,连服8周。选择健康查体的20例儿童作为正常对照组。2、肺高压患儿于用药前、用药4周及8周后分别留取静脉血5ml,对照组一次性抽取5ml。1ml用于检测患儿血小板、肝肾功能,1ml EDTA防凝,离心后留取血浆-20℃保存,用于ET-1含量测定;另外3ml立即分离血浆,-20℃保存,完成miR-27a测定,同时抽提单个核细胞,测定PPARγγ蛋白表达。3、肺高压患儿于用药前、用药后4周及8周超声心动图测患儿左心室射血分数EF值及肺动脉收缩压变化。4、血浆ET-1含量测定;ELISA方法测定正常对照组儿童及PAH患儿应用波生坦前、4周、8周后ET-1含量变化。5、外周血miR-27a表达测定:实时荧光定量PCR测定正常对照组及肺高压患儿应用波生坦前、4周、8周后循环血miR-27a表达变化。6、外周血PPARγ表达测定:Western blot测定正常对照组儿童及肺高压患儿应用波生坦前、4周、8周后循环血单个核细胞PPARy含量变化。结果1、波生坦2mg/kg,每日2次治疗左向右分流先天性心脏病合并PAH的儿童,疗程8周内,检测患儿肝肾功能和血小板计数进行比较,P>0.05差异无统计意义。2、超声心动图检查:口服波生坦治疗4周及8周后,与用药前作比较,射血分数EF值明显升高,P<0.01;同时肺动脉收缩压下降,P<0.05。3、血浆ET-1在PAH患儿表达增加,与健康对照组相比,P<0.01;口服波生坦后4周及8周,ET-1表达降低,同用药前比较,P<0.01。4、MiR-27a在左向右分流PAH患儿中表达增加,与健康对照组相比,P<0.01;口服波生坦治疗后4周及8周后,miR-27a在血浆中的表达降低,与用药前比较,P<0.01。5、PPARy蛋白在左向右分流肺动脉高压患儿表达降低,与健康对照组相比,P<0.01;应用波生坦治疗后4周及8周后,PPARγ蛋白的表达增强,与用药前比较,P<0.01。治疗8周后PPARγ蛋白的相对表达量与观察组比较,P>0.05,差异无统计学意义。结论1、波生坦短期治疗儿童肺动脉高压安全,疗效稳定。2、肺动脉高压患儿循环血中miR-27a表达增强,波生坦可降低肺高压患儿循环血中miR-27a表达水平。3、肺高压患儿外周血单个核细胞PPARy表达降低,波生坦干预可使得肺高压患儿外周血单个核细胞PPARy表达增强。