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全球经济的飞速发展依赖于能源的大量消耗,而化石燃料趋于枯竭,且其燃烧带来的污染和全球温室效益日益严峻,因此发展清洁、可再生能源已成为全球范围能源政策的重要组成部分。微藻生物柴油具有热值高,特性与化石柴油类似,可直接应用于现有内燃机中,对环境友好,不与粮争地且产量高等优点而备受重视。杜氏盐藻是最早进行商业化生产的微藻,具有抗逆性强,可在恶劣条件下生长,高价值产物含量高等优点,因此比其它油脂来源更具发展潜力。为此,本文以杜氏盐藻(Dunaliella salina)为研究对象,采用“一步检测法”检测杜氏盐藻的油脂、总糖、类胡萝卜素和叶绿素。以油脂含量为响应值,利用响应面法优化了杜氏盐藻的培养基组成。通过多种单因素实验优化培养条件提高杜氏盐藻油脂和类胡萝卜素含量,并对总糖和叶绿素含量进行了检测。最后,通过整合不同单因素达到协同作用,获得了最高油脂含量和类胡萝卜素含量。主要研究内容和结果如下:1.验证并优化了“一步测量法”方法。首先,确定盐藻油脂的吸收波长为260 nm,类胡萝卜素的吸收波长430 nm、450 nm和480 nm。其次,确定了杜氏盐藻生物量和油脂含量的标准曲线,并优化了油脂检测步骤,络合物形成的反应振荡时间设置为30 s,反应结束后3 h内应完成盐藻油脂含量测量。2.利用响应面法优化了盐藻培养基组成。确定盐藻积累油脂的最佳培养基条件为:NaSiO3添加量30.12 mg/L,Tris每200 mL培养基添加223μl母液,NaNO3添加量71.50 mg/L。3.通过单因素实验优化了杜氏盐藻积累油脂和类胡萝卜素的培养条件。(1)在培养基中添加80 g/L氯化钠最适合盐藻生长和积累油脂、类胡萝卜素。此时其油脂含量为0.134 mg/mL,比对照组(20 g/L氯化钠)的油脂含量(0.091 mg/mL)提高46.94%,同时其生物量也提高了11.05%(80 g/L氯化钠,Dw为600.5 mg/L;20 g/L氯化钠,Dw为540.8 mg/L),类胡萝卜素含量提高了3.94%(80 g/L氯化钠,类胡萝卜素含量为1.555μg/mL;20 g/L氯化钠,类胡萝卜素含量为1.496μg/mL)。(2)pH对油脂和类胡萝卜素积累作用有差异。p H7.5的培养基培养盐藻,其油脂含量为0.122mg/ml,比对照组(ph7)的油脂含量(0.116mg/ml)提高4.7%,ph8的培养基最适合盐藻生长,生物量(753.1mg/l)比对照组(ph7,528.7mg/l)提高42.4%,ph7的培养基积累类胡萝卜素(0.588μg/ml)最多。(3)在培养基中添加柠檬酸铁,其油脂含量(0.112mg/ml)比对照组(fecl3)的油脂含量(0.098mg/ml)提高了14.3%,同时生物量提高28.4%(柠檬酸铁,干重533.7mg/l;fecl3,干重415.9mg/l),类胡萝卜素含量提高10.6%(柠檬酸铁,类胡萝卜素含量1.915μg/ml;fecl3,类胡萝卜素含量1.732μg/ml)。(4)最适盐藻油脂积累培养方式为:盐藻接种于100ml培养基中,之后每7天添加50ml新鲜培养基,最终达到200ml,其油脂含量(0.096mg/ml)比对照组(一次添加)的油脂含量(0.070mg/ml)提高37.1%,同时生物量提高了43.3%(干重554.5mg/l;一次添加,干重386.9mg/l),类胡萝卜素含量提高10.6%(多次添加,2.099μg/ml;一次添加,类胡萝卜素含量1.636μg/ml)。(5)在培养基中添加10g/l葡萄糖,油脂含量(0.127mg/ml)比对照组(0g/l葡萄糖)的油脂含量(0.094mg/ml)提高35.1%,同时生物量增加了73.3%(10g/l葡萄糖,干重1226.4mg/l;0g/l葡萄糖,干重707.5mg/l),在培养基中添加15g/l葡萄糖培养盐藻积累类胡萝卜素最多,其类胡萝卜素含量(0.765μg/ml)比对照组(0g/l葡萄糖,类胡萝卜素含量0.298μg/ml)提高156.7%。(6)在培养基中添加100mg/l锌离子,油脂含量(0.1153mg/ml)比对照组的(油脂含量0.104mg/ml)提高11.3%,同时类胡萝卜素含量提高了121.6%(100mg/l锌离子,类胡萝卜素含量0.676μg/ml;0mg/l锌离子,类胡萝卜素含量0.305μg/ml),培养基中不添加锌离子最适合盐藻生长(干重709.2mg/l)。(7)利用半连续缺氮方式培养盐藻,其油脂含量(0.123mg/ml)比对照组的(油脂含量=0.072mg/ml)提高70.4%,半连续缺磷培养最适盐藻生长和类胡萝卜素积累,其生物量(720.1mg/l)比对照组的(526.9mg/l)提高36.9%,同时类胡萝卜素含量提高19.2%(p-,类胡萝卜素含量2.672μg/ml;对照组,类胡萝卜素含量2.242μg/ml)。4.通过多策略联合协同作用提高了杜氏盐藻的油脂和类胡萝卜素含量。实验组H生物量(687.7 mg/L)最高,比对照组(480.5 mg/L)提高了43.1%,仅次于实验组H的是实验组F和实验组N,生物量分别为612.6 mg/L和630.7 mg/L,分别比对照组提高了27.5%和31.2%。实验组F和实验组N盐藻积累油脂最多,分别为0.149mg/mL和0.147 mg/mL,比对照组(油脂含量0.083 mg/mL)提高了79.8%和76.5%;类胡萝卜素的含量分别为1.827μg/mL和1.978μg/mL,比对照组(类胡萝卜素含量1.559μg/mL)提高了17.2%和26.9%。综合考虑盐藻积累油脂和类胡萝卜素的含量,实验组F与N培养盐藻积累油脂之间差异不明显,但实验组N积累类胡萝卜素比实验组F多且差异显著(P<0.05)。因此,选择实验组N作为培养盐藻的最优策略。具体策略为:采用多次添加培养方式,在初始培养基中添加100 mg/L锌离子,培养20d后采用半连续氮缺失继续培养盐藻2d,然后收获藻体,就会获得高的油脂和类胡萝卜素含量。