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鸡球虫病是由艾美耳属球虫寄生于鸡肠上皮细胞内引起的一种以肠道损伤为主要特征的细胞内原虫病。鸡球虫病呈全球性分布,是集约化养鸡场中危害最为严重的寄生虫病,给规模化养鸡场带来巨大损失。目前球虫病的主要防控措施是药物预防,长期大量的药物投入使球虫产生了耐药现象,同时带来了药物残留问题。虽然球虫卵囊活疫苗的研发和应用是球虫病防控的新策略,但弱毒活疫苗也存在制备和保存困难以及疫苗毒株毒力返强现象,这些问题的根本原因是目前对鸡球虫入侵宿主细胞的机制尚不明确。子孢子入侵肠道上皮细胞是球虫建立感染的前提和基础,在早期阻断子孢子入侵是预防球虫病的一种可行的方案。研究表明顶复门原虫入侵宿主细胞是由微线蛋白、棒状体蛋白以及致密颗粒蛋白等多种蛋白之间相互作用引导的一系列复杂的串联过程,在对疟原虫以及弓形虫的研究中发现速殖子入侵宿主过程中,顶膜抗原-1与棒状体颈部蛋白RON2/4/5/8之间相互作用形成的滑动连接结构是连接虫体和宿主细胞之间的重要结构。目前对球虫入侵鸡肠道上皮细胞的机制研究较少,柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1与棒状体颈部蛋白-2之间是否存在相互作用还尚未得到证实。因此本研究利用酵母双杂交技术、GST-Pull down、免疫共沉淀以及双分子荧光互补技术鉴定了柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1与棒状体颈部蛋白-2之间的相互作用,为揭示鸡球虫入侵宿主细胞的分子机制提供了理论基础。在此研究基础上,通过虚拟筛选技术寻找二者之间相互作用的潜在的阻断剂,为新型抗球虫药及疫苗靶标的开发提供参考。EtAMA1与EtRON2互作的酵母双杂交鉴定:以柔嫩艾美耳球虫子孢子cDNA为模板,PCR扩增EtAMA1和EtRON2基因,构建酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-EtAMA1及捕获载体pGADT7-EtRON2并分别转化Y2HGold酵母菌中,观察酵母在营养缺陷选择培养基上的生长情况,EtAMA1和EtRON2均对酵母双杂交系统无自激活和毒性作用。pGBKT7-EtAMA1/pGADT7-EtRON2共转化菌能激活酵母双杂交报告系统,使共转化酵母菌在平板上生长出蓝色菌落,证明EtAMA1与EtRON2在酵母中存在相互作用。EtAMA1与EtRON2互作的GST-Pull down鉴定:构建原核表达载体pGEX-4T-EtAMA1和pET-32a-EtRON2,原核表达并纯化GST-EtAMA1和His-EtRON2融合蛋白进行GST-Pull down试验,GST-EtAMA1与His-EtRON2孵育的洗脱液中可以检测到His-EtRON2融合蛋白,而对照组GST标签蛋白与His-EtRON2孵育后的洗脱液中未检测到His-EtRON2融合蛋白,说明EtAMA1与EtEtRON2可以在体外相互作用。EtAMA1与EtRON2互作的免疫共沉淀鉴定:构建真核表达载体pcDNA3.1-His-EtAMA1和pcDNA3.1-HA-EtRON2并转染HEK-293T细胞并收集细胞裂解液,免疫共沉淀试验进一步证实EtAMA1与EtEtRON2在真核细胞内存在相互作用。EtAMA1与EtRON2互作的双分子荧光互补鉴定:构建双分子荧光互补载体pEtAMA1-Myc-LC151和pEtRON2-HA-KN151并转染HEK-293T细胞,激光共聚焦观察EtAMA1和EtRON2可在细胞中相互结合使荧光片段互补发出红色荧光,证明了二者在细胞内的相互作用。EtAMA1与EtRON2互作阻断剂的虚拟筛选:通过分子对接和虚拟筛选技术得到了六个EtAMA1与EtRON2蛋白互作的候选阻断剂,体外试验结果显示ZINC5416294、ZINC5759756、ZINC144203594三种小分子化合物对柔嫩艾美耳球虫子孢子的入侵抑制率分别为44.07%、39.68%、42.85%。综上所述,本研究利用酵母双杂交、GST-Pull down、免疫共沉淀及双分子荧光互补技术鉴定了柔嫩艾美耳球虫顶膜抗原-1与棒状体颈部蛋白-2之间存在相互作用,为揭示鸡球虫入侵宿主细胞过程中的分子机制提供了理论基础,通过虚拟筛选得到的三种小分子化合物对柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵细胞均有一定抑制作用,为新型药物的开发提供了参考。