论文部分内容阅读
酚氧化酶(phenoloxidase,EC.1.14.18.1,简称 PO)广泛存在于动物、植物和微生物等生物体内,是昆虫体内的一种重要酶类,在昆虫变态发育和免疫系统中起着重要作用。本文进行了菜青虫不同虫态及虫龄的酚氧化酶的性质比较、菜青虫酚氧化酶初纯化方法、酶学特性及效应物对酶活力的影响等研究。结果表明: 1. 菜青虫不同虫态及相同虫态不同龄期的酚氧化酶活力存在差异。幼虫期随着龄期增大酚氧化酶活力逐渐提高,蛹期随着化蛹后蛹日龄的增加酶活力逐渐降低。其中以 5 龄幼虫酶活力最高,5 日龄蛹的酶活力最低。 2. 菜青虫不同虫态及龄期的酚氧化酶性质存在差异。3、4、5 龄幼虫和予蛹最适温度分别为 36.0℃、38.5℃、43.0℃和 45.5℃,最适 pH 值为7.0,催化邻苯二酚的活化能(Ea)分别为 43.10、36.50、25.79 和 30.10kJ·mol-1。化蛹后不同日龄蛹最适温度为 50.0℃,最适 pH 值为 7.0,催化邻苯二酚的 Ea为 58.8 kJ·mol-1。 3. 对菜青虫酚氧化酶进行分离纯化,结果表明:酶活力存在于 35%饱和度硫酸铵的沉淀中,得率为 69.52%,比活力比粗酶液提高 3.08 倍。经 Sephadex G-100 凝胶过滤层析进一步纯化,测得比活力为粗酶的 6.22倍,得率为 42.50%。 4.研究部分纯化的菜青虫酚氧化酶的性质得出,最适 pH 值为 7.0,pH在 6.5～7.4 范围内酶保持稳定的活力。最适温度为 42℃,当温度低于 32℃时,酶具有稳定的活力。在 37℃ pH6.80 下求得酶催化 L-多巴的米氏常数(Km)为 1.35 mmol·L-1,催化邻苯二酚的 Km为 19.20 mmol·L-1。求得酚氧化酶催化 L-多巴氧化反应的 Ea为 42.77 kJ·mol-1。 5.研究金属离子对酶活力的影响,结果表明:K+、Li+和 Na+对酶活力无抑制效应;Mg2+、Ba2+和 Ca2+对酶活力有不同程度的激活作用,激活程度为:Mg2+> Ca 2+ > Ba2+;过渡金属离子 Mn2+、Co2+和 Zn2+对酶亦有不同程度的激活作用,Cu2+ 对酶活力的影响为浓度在 0～0.10 mmol·L-1时表现激活作用,浓度大于 0.13 mmol·L-1表现抑制作用。 6.研究有机溶剂对酶活力的影响,结果表明有机溶剂对酶活力均有一定程度的抑制作用。求得乙醇、丙二醇、丙三醇、正丙醇、丙酮和二氧六环导致酶活力下降一半所需的抑制剂浓度(IC50)分别为 2.13、2.04、2.25、 1<WP=7>薛超彬:菜青虫酚氧化酶的性质及抑制剂对其活性的抑制作用研究1.06、2.00 和 0.47mmol·L-1,求得甲醛和戊二醛对其 IC50 分别为 3.39 和 1.00μmol·L-1。 7. 测定了槲皮素、4-己基间苯二酚、4-十二烷基间苯二酚、苯甲酸及其衍生物、苯甲醛和铜铁试剂对酶活力的抑制作用及抑制常数,并探讨了它们的抑制机理,结果表明: (1)槲皮素对酶表现可逆抑制效应,为竞争型抑制类型,即底物与抑制剂同酶分子的结合是互相竞争的,抑制剂只能与游离酶(E)结合,而不能与酶-底物络合物(ES)结合。其 IC50 为 0.13mmol·L-1,抑制常数(KI)为 0.143mmol·L-1。 (2)4-己基间苯二酚和 4-十二烷基间苯二酚对酶表现可逆抑制效应,均为竞争型抑制类型,其 IC50 分别为 1.50 μmol·L-1和 1.12 μmol·L-1,KI分别为 0.50 μmol·L-1和 1.15μmol·L-1。 (3)苯甲酸及其衍生物对酶表现可逆抑制效应。苯甲酸和 p-环己基苯甲酸为非竞争型抑制类型,即抑制剂与酶分子的结合与底物分子与酶的结合是相互独立的,抑制剂不改变酶对底物的亲和力。其 IC50 分别为 14.2mmol·L-1 和 2.1 mmol·L-1, KI(KI=KIS)分别为 14.25 mmol·L-1 和 2.21mmol·L-1。p-羟基苯甲酸为竞争型抑制类型,其 IC50 为 11.3 mmol·L-1,KI为 7.46 mmol·L-1。p-氰基苯甲酸为混合型抑制类型,其 IC50 为 16.1mmol·L-1,KI 为 39.95 mmol·L-1,KIS 为 28.61 mmol·L-1。 (4)苯甲醛对酶表现可逆抑制效应,为非竞争型抑制类型,该效应物对酶的抑制作用较弱,甚至不能测得其 IC50。KI 和 KIS (KI=KIS)为586.28 mmol·L-1。 (5)铜铁试剂对酶表现可逆抑制效应,为竞争型抑制类型,其 IC50 为0.10 mmol·L-1,KI 分别为 0.076 mmol·L-1。