论文部分内容阅读
三聚氰胺(Melamine)是一种工业化工原料，近年来被发现非法添加于乳制品中用于蛋白质掺假，危害消费者健康。目前针对三聚氰胺的检测方法主要采用仪器分析法。仪器方法虽然准确度高和稳定性好，但是成本高、前处理繁琐，并且需要专业的操作人员，很难满足快速检测需求。免疫分析法具有简单、快速、可靠和低成本的优点，适用于样品大规模快速的筛查，在食品安全领域中表现出越来越重要的作用。本文旨在建立三聚氰胺酶联免疫分析法(Enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)和荧光偏振免疫分析法(Fluorescence polarization immunoassay，FPIA)两种方法，主要研究内容和结果如下： 1.三聚氰胺酶联免疫分析 将三聚氰半抗原(2，4-二氨基-6-肼基-1，3，5-三嗪，半抗原A)偶联于载体蛋白合成出三聚氰胺人工抗原，免疫新西兰大白兔后，获得了一种未见报导的多克隆抗体，进而建立三聚氰胺间接竞争酶联免疫吸附法(indirect competitive enzyme-linkedimmunosorbent assay，icELISA)；结果表明：所获抗体对三聚氰胺具有较高的特异性，三聚氰胺icELISA方法的检测限(Limit of detection，LOD)为8.6 ng/mL，检测范围为14.3-90.9 ng/mL，半抑制药物浓度(50％inhibition concentration，IC50)为35.4 ng/mL；该抗体仅与环丙氨嗪的交叉反应率为(17.1％)，与其它结构类似物并无显示出明显的交叉反应；对牛奶和酸奶样品的回收率分别为89.4％-95.6％和94.9％-114.9％，变异系数在2.3％-13.3％之间；icELISA方法检测牛奶样品的结果与HPLC-MS方法具有良好的相关性，线性相关系数R2=0.9974。 2.三聚氰胺荧光偏振免疫分析 将三聚氰半抗原分别与异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)和FITC乙二胺衍生物(1.(2-aminoethyl)-3-(3’，6’-dihydroxy-3-OXO-3H-spiro[isobenzofuran-1，9’-xanthene]-5-yl)thiourea，EDF)偶联，合成了三种具有不同结构和空间手臂长度的三聚氰胺荧光示踪物(Tracer)；通过比较灵敏度，筛选最优示踪物，优化反应时间等检测条件，建立三聚氰胺FPIA检测方法；结果表明：间隔手臂最长的荧光示踪物tracer C(6-(4，6-diarnino-1，3，5-triazin-2-ylamino)-N-(2-(3-(3’，6’-dihydroxy-3-oxo-2，3-dihydrospiro[indene-1.9’-xanthene]-5-yl)thioureido)ethyl)hexanamide)为最优示踪物，用其建立的三聚氰胺FPIA方法检测限(LOD)为9.3 ng/mL，检测范围为24.1-964.4ng/mL，半抑制药物浓度(IC50)为164.7 ng/mL；对牛奶和奶粉样品的回收率分别为79.4％-105.6％和86.6％-119.0％，变异系数在12.1％-25.4％之间；FPIA方法检测牛奶样品的结果与HPLC-MS方法具有良好的相关性，线性相关系数R2=0.9982。 3.三聚氰胺单试剂荧光偏振免疫分析 将三聚氰胺示踪物与抗体混合反应后制备单试剂免疫复合物，优化反应时间，进而建立了三聚氰胺单试剂荧光偏振免疫分析法(Single reagent-fluorescencepolarization immunoassay，SR-FPIA)；该法检测限(LOD)为3.2 ng/mL，检测范围为12.2-1012.4 ng/mL，半抑制药物浓度(IC50)为157.1 ng/mL；单试剂免疫复合物可以在4℃下稳定保存一个月。 本研究首次获得了一种新的三聚氰胺抗体，建立了三聚氰胺的酶联免疫分析和荧光偏振免疫分析检测方法，为进一步开发免疫分析试剂盒奠定了基础。