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低温是限制植物分布,影响植物生长发育的重要因素。植物处于低温环境中时,最初感知到冷信号后,机体在Ca2+、激素（如ABA）以及各种渗透调节物质水平上发生变化。这些变化通过一系列的信号转导,最终诱导冷调节基因调控网络的启动,从而调控植物机体的抗冷性。在冷胁迫响应过程中发挥重要作用不仅包括这些生理指标,还有各种转录因子的参与。FAD2基因是编码脂肪酸脱氢酶的基因。在高等植物中,FAD2基因大多都存在2个以上的拷贝,且不同拷贝的FAD2基因的表达模式以及功能也各不相同。植物中的FAD2基因分为两类:一类为组成性表达的,主要参与膜脂中不饱和脂肪酸的合成;另一类为种子特异性表达的,主要在储藏脂不饱和脂肪酸合成过程中发挥作用。前期研究中,本实验室已得到两个拷贝的FAD2基因（AhFAD2A和AhFAD2B）,这两个基因中存在着可变剪接,其中已确定在种子中表达的A2和B2剪接体参与储藏脂不饱和脂肪酸的合成。A4B4剪接体为组成性表达,推测该剪接体与膜脂的合成有关。另外,在花生基因组中可能还存在着其他拷贝的FAD2。基于这些问题,对花生ESTs数据库进行了比对分析,通过拼接序列的同源分析,发掘新的FAD2基因;通过qRT-PCR对FAD2基因进行不同组织的表达模式分析和低温胁迫响应表达模式分析;通过转基因拟南芥GUS表达系统对表达模式进一步分析;构建冷胁迫叶片酵母表达文库,试图通过酵母单杂交挖掘与FAD2相互作用的调控因子。通过上述的研究,主要取得了以下几个结果:（1）通过花生数据库ESTs序列分析比对,克隆得到两个新的FAD2基因拷贝,AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2。两个基因的cDNA大小均为1152bp,编码383个氨基酸;cDNA水平上有12个碱基位点差异,其中只有483位和720位碱基差异导致氨基酸水平上的不同。克隆的gDNA大小分别为5089bp和5090bp;两个基因的内含子均位于起始密码子ATG上游的5′UTR区域内,长度分别为3821bp和3822bp。通过比对AhFAD2-2氨基酸序列与其他物种FAD2氨基酸序列,发现与AhFAD2-2聚在一支的均属于housekeeping-type FAD2。其中与野生种花生FAD2-2亲缘关系最近,其次与大豆GmFAD2-2、棉花GhFAD2-2和柠条锦鸡儿CkFAD2的亲缘关系较近,而与拟南芥AtFAD2、油菜BnFAD2、向日葵HaFAD2亲缘关系相对较远。花生AhFAD2-2与AhFAD2A、AhFAD2B聚在不同分支。说明这是两类FAD2基因,后者属于seed-type FAD2。同时,在花生FAD2-2氨基酸序列中具有与其同源序列一致的高度保守的结构。如存在着5个跨膜结构域、3个高度保守性的组氨酸簇（HECGHH、HRRHH、HVAHH）以及C-末端含芳香族氨基酸的序列（-YNNKL）等结构。另外,对存在于AhFAD2-2的5′UTR区的内含子进行调控元件分析,发现存在一些与控制基因高效转录的元件、光调控相关的元件以及参与胁迫响应途径的元件等。（2）在AhFAD2-2的表达模式分析结果中,发现在植物体中为组成性表达且显著响应低温胁迫。它们在所有器官中都有表达,其中叶片中表达量最高,种子中最低,并且发育种子前期表达量大大的高于后期。低温处理的叶片中,在处理12h之内,表达量显著增加,在12h后表达量明显降低。恢复室温处理24h时,样品组表达量始终低于对照组。分析AhFAD2基因A4B4剪接体在低温胁迫下的表达模式,结果显示,AhFAD2基因在低温胁迫下具有一定的响应。在低温处理花生叶片2h之内表达量达到最高,之后随着处理时间的延长,表达量降低。恢复室温处理24h内,表达量小幅度增加。在GUS表达系统中,不同结构的表达模式分析结果表明:在幼苗期的子叶中,P2结构和P3结构均为轻微表达,P4结构则表现为强烈表达;在花器官的花药和柱头上,P2、P3和P4结构均有表达,表达程度相似;在茎生叶的叶尖和茎叶连接处,P2、P3和P4结构均有轻微表达。在胚中,P2、P3和P4结构均强烈表达。冷胁迫处理,各转化结构幼苗中GUS基因表达没有明显变化。（3）构建了冷胁迫下花生叶片的的酵母cDNA文库,库容量达7.8×107/mL。启动子分析发现AhFAD2基因的A4B4剪接体中存在着低温相关的ACGT ABRE MOTIF以及CGCG BOX AT等调控元件。根据调控元件设计用于酵母单杂交的目的和突变序列,并构建完成诱饵载体和诱饵酵母菌株,为挖掘与FAD2相互作用的调控因子奠定基础。本研究目前取得的结果还比较初步,对于AhFAD2-2基因,接下来我们还将通过mRNA in-situ等方法深入研究其表达模式和冷胁迫应答模式,结合转基因功能分析,深入了解AhFAD2-2的表达对膜脂不饱和脂肪酸组成的影响。AhFAD2-2基因中内含子是否具有增强基因表达等调控功能,我们还将对调控元件的功能进行验证。对于AhFAD2A和AhFAD2B基因,我们期望尽快利用酵母单杂交技术筛选出目的基序相互作用的转录因子,然后对筛选得到的转录因子进行表达模式分析,转录激活分析以及与AhFAD2基因结合的调控区分析,最终通过功能验证明确转录因子调控AhFAD2基因不同剪接体在膜脂中不饱和脂肪酸积累过程中的功能。