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自噬（autophagy），是通过自噬小体的形成及溶酶体的参与对细胞自身长寿命蛋白和废用的细胞器进行降解，并对一些氨基酸、蛋白质重新再利用的过程，以此达到维持细胞的稳态（homeostasis）。自噬对肿瘤的发生、发展发挥着促癌或者抑癌的双向作用，这种看似矛盾的现象同样存在于肿瘤的治疗过程。自噬在乳腺癌的化疗和放疗过程中会导致抵抗或者促进治疗的双重作用，取决于不同的治疗方案或肿瘤背景。对自噬分子机制的研究和发掘自噬调控因子并且能转化为临床治疗上的应用必将有益于肿瘤的治疗。microRNA（miRNA）是近年来发现的一类短链（~22nucleotides）非编码的RNA，其功能不断的被发现。miRNA主要是通过与靶基因的3’ UTR(untranslate region)部分结合，在其他功能蛋白的参与下发挥着抑制靶基因表达的作用，从而参与机体内各种生理过程（如自噬和凋亡等）。近年来，miRNA对靶基因表达上调的作用也有报道，其机制还需进一步的探索。在多种病理过程中miRNA通过调控自噬相关基因发挥作用，尤其是癌症。近年来研究发现，miR-199a-5p在多种肿瘤组织（肝癌、睾丸癌、乳腺癌等）中表达降低，提示miR-199a-5p可能是一种抑癌miRNA。而miR-199a-5p对自噬是否发挥调控作用及其机制尚未见报道。目的：阐述miR-199a-5p在电离辐射（ionizing radiation，IR）诱导乳腺癌细胞自噬过程中的作用及其机制，并探讨miR-199a-5p在乳腺癌治疗过程中的作用。方法：（1）应用qRT-PCR方法检测细胞内miRNA的表达；（2）Western blot检测蛋白水平变化；（3）应用GFP-LC3形态学方法检测自噬，Western blot检测MAPLC3I/II蛋白转换；（4）采用生物信息学方法预测miR-199a-5p的靶基因；（5）采用PCR获取靶基因3’UTR片段，基因工程方法构建双荧光素酶表达载体；（6）双重PCR定点突变合成突变子，构建突变子载体；（7）荧光素酶报告基因分析验证miR-199a-5p与靶基因3’UTR的结合；（8）CCK8（Cell countingKit-8）法检测细胞增殖活性；（9）流式细胞术检测细胞周期；（10）应用深部X射线治疗机进行细胞照射；（11）应用Student’s t-test或卡方检验分析数据，p<0.05表示差异有统计学意义。（12）ImageJ软件对蛋白电泳条带做灰度分析。结果：（1）电离辐射改变乳腺癌细胞中miR-199a-5p的表达水平MCF7细胞经照射后miR-199a-5p的表达高于假照组3倍以上，而MDA-MB-231细胞照射后miR-199a-5p的表达明显降低。与阴性对照（NC）组比较，MCF7转染mimic后，miR-199a-5p表达升高20倍，MDA-MB-231转染mimic后miR-199a-5p表达升高65倍。转染组经照射处理后miR-199a-5p表达进一步升高，MCF7细胞中miR-199a-5p表达高于NC组50倍以上，MDA-MB-231细胞中miR-199a-5p表达高于NC组90倍以上。（2） miR-199a-5p在MCF7细胞中抑制电离辐射诱导的自噬MCF7细胞经过8Gy照射后16h、32h，蛋白电泳检测MAPLC3II/LC3I比值，分别升高到1.28、1.29倍。通过GFP-LC3形态学方法检测自噬水平，发现MCF7本底水平的自噬细胞为7%，IR组自噬细胞升高到35%（**p<0.01）。在应用脂质体转染miR-199a-5p mimic和NC后，自噬水平没有受到明显的影响（p>0.05）。在NC+IR组，自噬水平升高并超过35%（**p<0.01）。而在mimic+IR组，自噬率为15%，低于IR组和NC+IR组，但高于NC组和假照组（**p<0.01）。8Gy照射后检测MAPLC3蛋白表达，发现IR组MAPLC3II的表达水平明显高于假照组，mimic+IR组MAPLC3II表达水平明显低于IR组和NC+IR组。而单纯转染NC和mimic两组的MAPLC3II表达水平与假照组差别不明显。氯喹（chloroquine，CQ）在自噬过程中通过抑制溶酶体水解来抑制自噬进程，会导致自噬小体的累积，可用来评估自噬通量（Autophagy flux）。MCF7细胞转染mimic和NC，顺次给予CQ、IR处理。与NC组比较，LC3II/LC3I的比值在NC+IR组、mimic+IR组、NC+IR+CQ组、mimic+IR+CQ组均升高，分别升高到2.13倍、1.28倍、2.71倍和1.81。提示miR-199a-5p对电离辐射诱导MCF7细胞自噬有抑制作用。（3）miR-199a-5p在MDA-MB-231细胞中激活自噬并增强辐射诱导的自噬蛋白电泳检测MDA-MB-231细胞电离辐射后8h、16h MAPLC3II/LC3I比值分别升高到2.16、1.62倍。MDA-MB-231细胞转染miR-199a-5p mimic后，与NC组比较，mimic组、NC+IR组、mimic+IR组MAPLC3II/LC3I比值均升高，分别达到1.44倍、1.10倍、1.59倍。分析自噬通量的变化，加入CQ处理后NC+CQ组的MAPLC3II/LC3I值较NC组升高(达到1.47倍)，而mimic+CQ组MAPLC3II/LC3I值升高明显（达到1.97倍），高于NC+CQ组和mimic组。通过CQ阻滞自噬在晚期阶段的进展表明，mimic能够激活和促进MDA-MB-231细胞的自噬。（4）miR-199a-5p靶基因预测和荧光素酶载体的构建通过miRNA生物信息学预测工具（miRBase、PicTar和Targetscan）初步预测，两个自噬相关基因DRAM1和BECN13’UTR与miR-199a-5p的seed部位有着互补结合。应用PCR方法调取DRAM1和BECN1基因3’UTR序列，构建在荧光素酶表达载体上，分别构建PGL3-DRAM1和pMIR-BECN1荧光素酶载体。通过双重PCR定点突变的方法合成3’UTR突变体，构建突变体荧光素酶载体。构建的载体经测序确认位置和序列的正确性。（5）MCF7细胞中miR-199a-5p抑制DRAM1和BECN1表达将miR-199a-5p mimic或者NC与荧光素酶载体共同转染进入MCF7细胞，以pRL-SV40作为内参。结果发现，共转染后PGL3-DRAM1和pMIR-BECN1荧光素酶活性值分别降低到70%和75%（*p<0.05）。而将miR-199a-5p mimic与突变体荧光素酶载体PGL3-DRAM1mut和pMIR-BECN1mut载体共转染，结果荧光素酶的活性无改变。MCF7细胞给予电离辐射处理后，DRAM1和BECN1表达高于假照组（mock组），转染mimic组的DRAM1和BECN1表达低于NC组，mimic+IR组DRAM1和BECN1表达低于NC+IR组。（6）MDA-MB-231细胞中miR-199a-5p上调DRAM1和BECN1表达MDA-MB-231细胞转染miR-199a-5p mimic后DRAM1和BECN1蛋白的表达升高，NC+IR组DRAM1和BECN1表达高于NC组。在MDA-MB-231细胞中，通过共转染miR-199a-5p minic（或者NC）与荧光素酶表达载体并以pRL-SV40作为内参，检测荧光素酶表达活性。结果发现，PGL3-DRAM1和pMIR-BECN1荧光素酶活性分别升高1.2倍和2.7倍(**p<0.01)。共转染miR-199a-5p mimic与突变体荧光素酶载体，荧光素酶的活性没有改变。（7）miR-199a-5p增加电离辐射对MDA-MB-231细胞增殖活性抑制作用将MCF7和MDA-MB-231细胞转染miR-199a-5p mimic或者NC后，给予不同剂量的电离辐射（0、2Gy、4Gy、6Gy）处理，继续培养72h后检测细胞的增殖活性。MDA-MB-231细胞中mimic+4Gy组和mimic+6Gy组细胞增殖活性分别减低至90%和75%（**p<0.01)，NC+6Gy组细胞增殖活性降低至82%（**p<0.01)。MCF7细胞中各个剂量的电离辐射对NC组和mimic组细胞活性没有产生明显的影响。（8）miR-199a-5p对细胞周期的影响流式细胞术检测细胞周期的变化。结果发现，MCF7细胞NC组、mimic组、IR组和mimic+IR组G2/M期细胞比例分别为2.72%、2.05%、13.35%和3.2%，表明IR组发生G2/M阻滞。MDA-MB-231细胞NC组、mimic组、IR组和mimic+IR组G2/M期细胞比例分别为5.23%、18.56%、23.61%和5.34%，表明mimic组和IR组发生G2/M期阻滞。结论:（1）miR-199a-5p在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中对自噬发挥着不同的调控作用，在MCF7细胞中miR-199a-5p抑制电离辐射诱导的自噬，在MDA-MB-231细胞中直接激活自噬，并增强电离辐射诱导的自噬。（2）自噬相关基因DRAM1和BECN1是miR-199a-5p的靶基因。在MCF7细胞中miR-199a-5p通过与3’UTR结合抑制两个靶基因的表达，而在MDA-MB-231细胞中通过与3’UTR结合直接上调两个基因的表达。（3）miR-199a-5p在MCF7和MDA-MB-231细胞中对细胞周期的调控作用不同，可能是引起miR-199a-5p对靶基因作用截然相反的原因。（4）miR-199a-5p可以促进电离辐射对MDA-MB-231增殖活性抑制作用。综上所述，本研究丰富了miRNA-自噬调控网络，发现了新的调控自噬的miRNA，且发现miRNA对靶基因及生物功能的调控因细胞背景的不同而存在差异的调控作用，为miRNA功能和机制的研究提供新的视角。同时，提示临床肿瘤的治疗需要依据肿瘤背景的不同提供个性化的治疗方案。但miRNA对靶基因的调控机制，尤其是上调靶基因的机制还需更多的工作深入的研究。