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核黄素结合蛋白(riboflavin binding protein, RBP)是禽蛋中天然存在的一种糖磷蛋白,分别具有一个核黄素和二价铜离子结合位点,在胚胎发育过程中发挥着重要作用。但目前关于RBP与核黄素及铜离子的结合机制仍不完善。本文采用硫酸铵盐析结合离子交换法的工艺对蛋清中RBP进行分离纯化后,分别运用荧光光谱、紫外可见光谱、傅立叶变换红外光谱和电化学法研究其与核黄素及铜离子的相互作用。主要研究结果如下：1.采用硫酸铵盐析和离子交换层析相结合的工艺分离纯化RBP。研究了硫酸铵饱和度对核黄素结合蛋白粗提的影响,采用55%-85%两步(NH4)2SO4盐析,可以去除部分卵白蛋白、卵转铁蛋白和几乎所有的卵黏蛋白。同时对DEAE-Toyopearl650M离子交换层析纯化工艺条件进行研究,得出Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液pH值6.5,浓度0.1mol/L,NaCl洗脱浓度为0.25mol/L,最佳上样量200mL(样品浓度20mg/mL)。纯化后样品经HPLC鉴定纯度高达95.32%,总回收率为57.36%。荧光猝灭实验说明纯化获得的RBP保留了结合核黄素的活性。2.为了阐明Apo-RBP与核黄素的结合机制,运用紫外可见光谱、荧光光谱和红外光谱研究了Apo-RBP与核黄素的相互作用。荧光实验结果表明核黄素对Apo-RBP的猝灭机理是通过两者的结合而发生的静态猝灭。其中,二者的结合常数为5.35×108L·mol-1.结合过程中热力学参数AH为-88.87kJ/mol,ΔS为-131.34J/(K-mol),两者均小于零,说明核黄素与Apo-RBP间主要靠氢键和范德华力结合。同时,Forster能量转移理论确定了核黄素与Apo-RBP的作用距离和能量转移效率分别为0.70nm和0.39。结合核黄素后Apo-RBP紫外可见光谱及同步荧光光谱,表明核黄素的加入使Apo-RBP芳香族氨基酸残基的微环境疏水性增强。比较了结合核黄素前后的Apo-RBP FT-IR光谱发现蛋白的二级结构没有显著变化(P>0.05)。最后研究了不同金属离子对核黄素与Apo-RBP结合常数的影响,结果表明Zn2+、Cu2+、K+、Ca2+加入后核黄素与Apo-RBP的结合常数分别变化为3.26×109L-mol-1、3.69×108L-mol-1、0.72×107L-mol-1、9.83×105L-mol-1,说明Zn2+对两者之间的结合有增强作用,Ca2+、K+两种离子将降低两者间的结合,Cu2+对两者间的结合常数影响不大。3.采用光谱法研究Cu(II)与Apo-RBP之间的相互作用,结果表明Cu(II)对Apo-RBP的荧光猝灭机理属于静态猝灭。考察了温度、pH、核黄素、NaCl浓度对Cu(II)与蛋白质结合的影响,发现pH对Cu(II)与Apo-RBP结合影响作用较大,随着pH的升高Cu(II)与Apo-RBP的结合常数先升高达到平衡后又降低,最适pH为7.0-8.0；温度和NaCl浓度对两者间的结合常数影响不显著；由核黄素对两者结合影响的结果推测Cu(II)和核黄素与蛋白质非同一结合位点。另外通过ANS实验表明Cu(II)与Apo-RBP结合位点可能位于蛋白质疏水区域内。利用紫外可见吸收光谱、同步荧光光谱、傅里叶红外光谱研究了Apo-RBP与Cu(II)结合后Apo-RBP的构象变化,发现酪氨酸残基所处环境的疏水性增强,结合Cu(II)后RBP的α-螺旋由26.45%下降至17.48%、β-折叠由18.15%下降至14.01%、β-转角由18.40%下降至14.01%,同时无规卷曲由13.05%增大至23.91%,说明结合Cu(II)使Apo-RBP蛋白质结构伸展,结构由有序向无序转变。4.为了进一步探讨Cu(II)与Apo-RBP的结合机制,采用循环伏安法和差分脉冲伏安法研究了Cu(II)与Apo-RBP结合前后的电化学行为。结果发现pH7.0Tris-HCl缓冲液中Cu(II)有两个氧化峰和两个还原峰,而核黄素结合蛋白在扫描范围0.2V--1.0V内没有氧化还原峰,说明核黄素结合蛋白在该电压范围内没有电化学活性。加入Apo-RBP后,铜离子的循环伏安图中两个氧化峰电流分别从11.23μA和6.19μA下降至5.63μA和3.24μA；两个还原峰电流分别从5.03gA和14.28gA下降至3.03μA和11.02μA,同时差分脉冲伏安法测定的Cu(II)的两个氧化峰电流分别从16.14μA和15.69gA下降至15.69gA和5.55μA,表明Cu(II)与Apo-RBP相互作用形成非电化学活性的化合物,由此说明Apo-RBP具有稳定Cu(II)的氧化还原态,防止鸡蛋储存过程中有害氧化还原反应的发生。