四川部分地区空肠弯曲菌分离株耐药性及MLST分型分析

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空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni,C jejuni)是近十多年来受到国内外研究者广为关注的人畜共患病原菌,也是主要的食源性感染病原菌之一,故而对于该菌的防控具有重要的公共卫生学意义。近年来随着畜牧业及医学临床上抗生素的大量使用致使该菌的耐药性增强、耐药成因愈显复杂,增加了对该菌相关疾病防控的困难。本研究自四川多地区采集禽类盲肠内容物、粪便及奶牛粪便进行该菌的分离,并对分离株进行耐药表型与基因型相关性分析、耐药性与所含CRISPR-Cas系统的相关性分析及菌株MLST分型,旨在为了解分离株的耐药特性与其所含CRISPR-Cas系统的生物学信息的相关性,并基于分子分型以探究菌株间的遗传进化关系,为该菌的流行病学监测及防控提供一定参考。1.菌株分离鉴定、耐药性分析自四川多地区采集禽类盲肠内容物与粪便828份及牛源粪便样品649份,对于空肠弯曲菌进行分离,分离株经PCR鉴定后,共获得禽源空肠弯曲菌分离株为98株,牛源空肠弯曲菌分离株为34株,分离率分别为11.7%(98/828)、5.2%(34/649)。选用临床上常用的7类9种抗菌药物采用K-B纸片法初步判断分离株耐药情况,依据分离株的耐药情况后利用PCR检测相关耐药基因,分析耐药基因与耐药表型的相关性。药敏结果显示:分离株对青霉素、环丙沙星、萘啶酸、克林霉素的耐药性较高,分别为84.5%(112/132)、88.63%(117/132)、78.64%(104/132)、77.96%(103/132)、对四环素65.9%(87/132)、氯霉素59.1%(78/132)、庆大霉素40.9%(54/132)、红霉素54.54%(72/132)、氟苯尼考15.9%(21/132);对空肠弯曲菌耐药相关基因检测发现,cat携带率为93.6%(73/78),94.4%(68/74)的红霉素耐药菌株于23Sr RNA的V区2075位出现碱基A→G的置换;随机挑选的环丙沙星耐药菌株WJC2-6、JT-4、PX-3均在第257位发生碱基C→T的突变,耐氨基糖苷类药物的分离株中耐药基因簇aadE-sat4-aphA-3的携带率为31.5%(17/54),I类基因盒多携带有aadA2氨基糖苷类耐药基因盒,分离株的多重耐药率为89.4%(118/132)。2.菌株CRISPR-Cas系统生物信息学分析及其与耐药关联性利用生物信息学方法预测NCBI已公布的空肠弯曲菌所含的CRISPR-Cas系统,对其进行保守性比对分析、重复序列的GC含量分析及RNA二级结构预测并依据Cas蛋白序列、重复序列构建遗传进化树。结果显示:空肠弯曲菌染色体基因组上CRISPR-Cas系统的重复序列一致性为92.31%、GC含量为28.57%以下、差异性主要呈现于两端游离部分;因CRISPR中的间隔序列差异较大致使CRISPR具有多态性;Cas蛋白序列的同源性较高为96.8%以上,与基因水平转移的特征相符。依据空肠弯曲菌CRISPR-Cas系统各基因的保守区段设计引物对于分离株进行CRISPR-Cas系统检测并对其所含的生物学信息进行分析;使用SPSS20.0软件对分离株CRISPR-Cas系统各基因阳性率与耐药阳性率进行统计分析以初步探究CRISPR-Cas系统与耐药之间的相关性。结果显示:分离株中56.1%(74/132)的菌株均存在完整CRISPR-Cas系统,少部分菌株缺失完整的CRISPR-Cas系统或缺失该系统的部分基因结构;以重复序列的一致性较低为88.9%,cas9基因的一致性为98.47%,可成茎环样RNA二级结构的重复序列依赖于其固有的结构;CRISPR序列与耐药基因间无显著相关性;菌株耐药阳性率与cas1、cas2基因的阳性率间无统计学意义,菌株耐红霉素阳性率与cas9基因的阳性率存在相关性且具有统计学意义。3.菌株MLST分型参照MLST数据库,选取空肠弯曲菌MLST分型7个管家基因aspA、glnA、glyA、gltA、tkt、pgm和uncA分别进行扩增并测序后聚类分析以初步探究菌株间的遗传进化关系。结果显示:选取的92株具有地区代表性的空肠弯曲菌分离株中共含38种不同的序列型,分属于11种不同的克隆系,以CC-21、CC-353、CC-464克隆系相对较多;遗传进化树显示,不同宿主、不同地区来源的分离株间具有遗传多样性。
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