妊娠高血压疾病(hypertensive disorder complicating pregnancy) HDCP是指妊娠20周后出现的特发性高血压综合征,其病理、生理变化涉及全身各系统,包括妊娠期高血压、子痫前期(Preeclampsia)、子痫、慢性高血压并发子痫前期以及妊娠合并慢性高血压共五种类型。发生率在我国为9.4%-10.4%,国外为7%-12%,是孕产妇和围生儿病死率增加的主要原因,严重影响母儿安全。重度子痫前期(Severe pre-eclampsia)是妊娠期高血压疾病的一种常见类型和重要的发病阶段,患者出现一过性的高血压、水肿、蛋白尿,其特征性病理变化是子宫螺旋小动脉生理性重铸障碍和内皮细胞损伤。关于重度子痫前期的发病机制存在很多学说却无统一定论,主要包括：免疫学说、遗传学说、异常滋养层细胞侵入子宫肌层、血管内皮受损、营养缺乏和胰岛素抵抗。其中免疫学说、遗传学说相互影响、相互渗透,逐渐形成了免疫遗传学说,成为子痫前期机制研究领域中最活跃的部分。免疫遗传的核心为组织相容,人类白细胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)作为病因学上一个重要的免疫遗传因子,是引发同种移植排斥反应的主要抗原,现多数学者认为携带父源性基因的胎儿对母体而言是一种同种半异体移植物。正常情况下,母、胎间存在免疫耐受,可保证母胎和平共处。在子痫前期状态下该免疫耐受被打破,可导致一系列类似于急性移植排斥反应的病理学改变,而胎儿一经娩出,则患者症状即可逆转。据此推测,妊娠是一种特殊的生理状态,无论正常或异常,均是母胎双方共同作用的结果。故致病基因既可能来自母体,也可能来自胎儿,或由母胎双方基因相互作用而致病。人白细胞抗原-G(human leucocyte antigen-G, HLA-G)是一种非经典的HLA-G I b类抗原,主要表达于母胎界面绒毛外细胞滋养细胞(extravillous cytotrophoblast,EVCT)上。这种严格的组织学分布及其在妊娠免疫耐受中所起的重要作用特别引人瞩目。作为免疫耐受分子之一,它可通过多种机制参与机体免疫耐受的诱导与维持,参与病理妊娠的发生与发展,是研究HLA与子痫前期发病机制中最为关键的一部分。包括本课题组在内的以往大量研究表明：子痫前期孕妇胎盘HLA-G mRNA和HLA-G蛋白表达异常或降低。当HLA-G表达缺陷时,可能导致母胎界面的免疫排斥反应增强,保护性反应减弱,滋养细胞侵入能力受损,导致胎盘浅着床,胎盘供流不足,最终引发子痫前期。近年来的研究发现,HLA-G基因多态性的存在可能是导致这一级联反应的始发原因。HLA基因的高度多态性导致了个体间免疫应答能力的不同和对疾病易感性出现差异。现在许多与HLA相关的疾病都需要以基因分型技术来重新研究,以便把易感基因定位于分子水平,为基因治疗奠定基础。HLA-G基因多态性包括编码区和非编码区的多态性。其中编码区的多态性有限,多是无意义的突变和缺失,该核苷酸序列的变化不引起氨基酸种类的改变,不改变蛋白的数量和功能,最新研究发现HLA-G 3’-非翻译区(3-untranslated region,3’-UTR)第8外显子(8th Exon,Exon 8)中的14bp缺失／插入位点多态性影响HLA-G的转录和表达,与病理妊娠密切相关。关于此多态性与复发性流产的易感性已被证实,但与重度子痫前期的关系尚未明确,需要做进一步的研究。越来越多的研究表明妊娠期母体免疫系统对胚胎移植抗原的免疫耐受的形成不仅仅是妊娠期母体免疫系统的功能被抑制,而是母胎间免疫调节达到平衡状态的结果。国内外许多研究也均证实单从母亲一方面考虑HLA-G基因多态性与重度子痫前期的关系是不全面的,这种特殊的妊娠状态可能是由于母胎双方基因相互作用所致。并且此多态性的分布会因地域、种族和人种的不同而存在差异,尚需做进一步的探讨。目的本研究采用聚合酶链反应技术(PCR),对河南地区汉族妇女中42对重度子痫前期孕妇及其新生儿和45对正常晚孕者孕妇及其新生儿,进行HLA-G基因第8外显子14bp缺失多态性的等位基因分型,分别比较两组孕妇之间和两组新生儿之间等位基因及基因型的频率分布,通过母／儿基因型配伍,比较两组间基因型配伍频率分布的差异。进而来研究河南地区汉族妇女重度子痫前期与此多态性的关系,为进一步探讨重度子痫前期的发病机制提供重要线索,也为临床上利用母胎间信息预测子痫前期的发病风险提供实验证据。材料与方法1研究对象选择2008年10月至2009年2月在郑州大学第三附属医院产科住院,经临床确诊的42对重度子痫前期孕妇及其新生儿为病例组。诊断标准按人民卫生出版社第七版《妇产科学》,并排除内分泌疾病、慢性高血压病、肾脏疾病、糖尿病、肿瘤、炎症等,且所有患者均随访至产后12周。患者平均年龄(30.60±5.76)岁,平均孕周为(35.95±3.22)周。另选择同期的正常晚孕的孕妇及其新生儿45对为对照组,平均年龄(30.09±4.80)岁,平均孕周为(36.52±1.56)周。两组孕妇均为河南地区居民、汉族、无异族通婚史、无血缘关系,并且孕妇年龄、孕周及孕产次比较,均无显著性差异(P>0.05)。2方法2.1标本采集分别抽取重度子痫前期和正常晚孕组孕妇外周静脉血2ml,同时于两组孕妇分娩时无菌抽取脐静脉血2ml,母、脐血均采用枸橼酸钠抗凝,-20℃冰箱冻存待检。2.2盐析法提取基因组DNA提取取冰冻全血室温解冻,裂解红细胞后在离心沉淀的白细胞中加入白细胞裂解液震荡悬浮,55℃水浴30min,冷却至室温,饱和氯化钠盐析后取上清液加入750μL无水乙醇充分颠倒混匀后,见絮状析出,70%乙醇500μL洗涤,室温至干,溶于三蒸水中,用紫外分光光度计测量其含量及纯度。调节DNA浓度至100ng/μl左右,-80℃保存备用。2.3HLA-G基因分型2.3.1引物设计根据PCR法进行设计,由上海英骏生物公司合成。Exon8部分片段：上游：5’-GTGATGGGCTGTTTAAAGTGTCACC-3’下游：5’-GGAAGGAATGCAGTTCAGCATGA-3’β-actin:上游：5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’下游：5’-GTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’2.3.2 PCR扩增反应体系采用25μl反应体系,包含10×Taqbuffer缓冲液2.5μl；2mM dNTPMix 2.5μl; 5μM HLA-G引物2μl；5μM内对照引物2μl；2.5U/LTaq DNA聚合酶0.5U；25mM MgCl2 1.5μl;基因组DNA 1μl；三蒸水13μl。96孔PCR反应板加盖石蜡油。2.3.3 PCR反应条件94℃预变性为5min,94℃30s,64℃1min,72℃2min,共循环35次,最后72℃延伸10 min。2.4 PCR扩增产物的电泳取5μl PCR产物直接加入含有0.5μg/ml 0.5×1000 Gelred核酸染色剂的3.5%琼脂糖凝胶电泳槽,100V电泳45min,于凝胶图象分析系统观察,拍照。根据14bp缺失多态性的不同,HLA-G基因的Exon 8 PCR扩增产物的电泳结果有三种,分别判读为：扩增产物为一条带,长度为210bp,可判读为缺失纯合子(-14bp／-14bp)；扩增产物为一条带,长度为224bp,可判读为插入纯合子(+14bp／+14bp)；扩增产物为两条带,长度分别为210bp和224bp,可判读为缺失杂合子(-14bp／+14bp)；长度为548bp的是内参片段β-actin。2.5 224bp和210bp扩增产物测序选取电泳图像均为单独一条带扩增产物,缺失纯合子(-14bp／-14bp)和插入纯合子(+14bp／+14bp)的PCR反应原液,送Invit rogen公司纯化并测序。测序结果与GenBank Blast比对,与HLA-G Exon8片段相符(GenBank登录号J52705)。224bp产物比210bp产物多了一段长度为14bp的基因序列：ATTTGTTCTTGCCT。3统计学处理采用SPSS13.0软件包进行统计学分析,应用拟合优度χ2检验判断基因型的分布是否符合Hardy-Weinberg平衡；两组间计量资料比较用单因素方差分析；直接计算法计算各组等位基因频率；等位基因的频率分布差异采用四格表法进行χ2检验,对不适合χ2检验条件的数据用Fisher精确概率法计算P值。当两组间等位基因、基因型频率或者基因型配伍具有显著差异(P<0.05)时,进一步计算其关联强度比值比(OR值)及95%可信区间(CI)。以a=0.05为检验水准。1两组孕妇临床一般资料比较分析重度子痫前期组和正常晚孕组孕妇临床资料,进行比较可知两组孕妇在年龄、分娩孕周上的差异均无统计学意义(P>0.05)；2HLA-G基因14bp缺失多态性分析重度子痫前期组和正常晚孕组孕妇及其新生儿的HLA-G基因14bp缺失多态性的基因型频率分布,均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05),该群体基因符合遗传平衡；2.1两组孕妇HLA-G14bp缺失多态性的等位基因、基因型频率比较重度子痫前期组孕妇HLA-G14bp缺失多态性等位基因频率：+14bp为34.5%、-14bp为65.5%,正常晚孕组依次为26.7%、73.3%,两组比较,差异无统计学意义(χ2=1.266 P=0.260)；两组孕妇间基因型比较：重度子痫前期组中缺失纯合子(-14bp／-14bp)、缺失杂合子(-14bp／+14bp)、插入纯合子(+14bp／+14bp)基因型的分布频率依次为42.9%、45.2%、11.9%,正常晚孕组中的频率依次为51.1%、44.4%、4.4%,各基因型分布频率进行比较,差异均不具有统计学意义(P>0.05)2.2两组新生儿HLA-G14bp缺失多态性的等位基因、基因型分布频率比较重度子痫前期组新生儿HLA-G14bp缺失多态性等位基因频率：+14bp为44.4%、-14bp为56.0%,正常晚孕组依次为30.0%、70.0%,两组比较差异无统计学意义(χ2=3.678 P=0.055)；两组新生儿间基因型比较：重度子痫前期组中缺失纯合子(-14bp／-14bp)、缺失杂合子(-14bp／+14bp)、插入纯合子(+14bp／+14bp)基因型的分布频率依次为28.5%、54.8%、16.7%,正常晚孕组中的频率依次为48.9%、45.2%、8.9%,各基因型分布频率进行比较,差异均不具有统计学意义(P>0.05)；2.3两组母／儿HLA-G14bp缺失多态性的基因型配伍比较重度子痫前期组中母／儿为缺失纯合子(-14bp／-14bp)的基因型配伍的频率为14.3%,显著低于正常晚孕组的33.3%,两组比较,差异具有统计学意义[χ2=4.304,P=0.038；OR=3.000(95%CI 1.036-8.690)]。余基因型配伍类型在两组间比较差异均无统计学意义(P>0.05)结论1中国河南地区汉族孕妇中,HLA-G基因14bp缺失多态性与重度子痫前期的易感性之间存在相关性；2母／儿为缺失纯合子(-14bp／-14bp)基因型配伍时,孕妇发生重度子痫前期的风险可能会降低。