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柑橘是世界上最重要的果树作物之一,在热带和亚热带地区广泛分布。柑橘属(Citrus L.)由林耐于1753年订立,系芸香科(Rutaceae)柑橘亚科(Aurantioideae)植物。Swingle于1943年,根据雄蕊数目及汁胞构造将柑橘及其近缘的五个属,金柑属(Fortunella Swingle)、枳属(Poncirus Raf.)、澳指檬属(Microcitrus Swingle)、澳沙檬属(Eremocitrus Swingle)及多蕊橘属(Clymenia Swingle)一起划分到真正柑橘果树类。柑橘及其近缘属植物具有丰富的生物活性物质,如类黄酮,类胡萝卜素、萜类等,并被报道具有抗氧化、抗炎、抗癌等生物活性。枳橙(Citrus sinensis x Poncirus trifoliata)是柑橘属与枳属的属间杂种。枳橙具有发达的根系和良好的抗寒抗病能力,在园艺栽培中被作为柑橘砧木广泛使用。在前人报道中枳橙的亲本枳和甜橙都富含如类黄酮等的生物活性物质。然而,有关枳橙果实的类黄酮成分分布,以及其相关的生物活性如抗氧化、抗肥胖等仍尚未见报道。本研究选取了四种常见的枳橙基因型,分别是卡里佐枳橙(cv.Carrizo,缩写C)、墨西哥枳橙(cv.Moxico,缩写M)、腊斯克枳橙(cv.Rusk,缩写R)、安陆枳橙(cv.Anlu,缩写A),以及卡里佐枳橙的亲本枳(Poncirus trifoliate Raf.,缩写T)和华盛顿甜橙(Citrus sinensis cv.Washington,缩写W)研究各果实提取物的黄酮类成分和抗氧化活性。首先,采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(Ultra Performance Liquid Chromatography-Q time of flight mass spectrometry,UPLC-Qtof-MS)对枳橙果实提取中的黄酮成分进行了鉴定。然后,通过高效液相色谱系统(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)和柱后衍生(Post-column Derivatization,PCD)系统联用,通过HPLC-ABTS方法,实现了在分离柑橘果实提取物中各黄酮类成分的同时,对各成分清除ABTS+自由基的速率进行了分析。此外,进行了快速高效的HPLC-ABTS-FRSD(柱后不同自由基检测系统,Free Radical Scavenger Detector,FRSD)对各枳橙样品总抗氧化活性的测定,并和离线抗氧化检测方法相结合,对各样品抗氧化能力以及其与总多酚总黄酮含量间的关系进行了分析。其次,为评价枳橙果实预防肥胖的功效,利用高脂膳食诱导的营养肥胖小鼠模型,我们对卡里佐枳橙果皮和果肉提取物对C57/BL6小鼠的体重的抑制以及相关的高血糖和脂代谢异常等的预防进行了研究。最后,我们利用实时荧光定量PCR技术对卡里佐枳橙提取物在过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptorα,PPARγ)以及肝脏X受体β(liver X receptorβ,LXRβ)等核受体信号通路中的调节作用进行了探讨。有关重要研究结果如下:1.枳橙果实黄酮类成分鉴定为了鉴定4种枳橙及2种可能亲本基因型果皮和果肉甲醇提取物中的类黄酮成分,利用UPLC-Qtof-MS系统对提取物进行分析,并通过标准品以及质谱碎片断裂方式对信号进行鉴定。使用系统条件:(1)色谱条件:流动相:A为甲醇,B为0.1%甲酸溶液;梯度洗脱程序条件:0—0.6 min 90%—80%A;0.6—6.5 min 80%—40%A;6.5—7 min40%—10%A;7—8 min 10%—90%A;流速:0.4 m L min-1;(2)离子化方式为ESI,毛细管电压0.45 k V;锥孔电压40 V;离子源温度为100℃;锥孔气流速50 L/h;脱溶剂气温度400℃;去离子气流速600 L/h;扫描范围从100 m/z到1000 m/z.数据响应时间为0.2 s。结果根据信号的质荷比鉴别出34种化学成分。其中,鉴定出卡里佐枳橙果皮中的黄酮类成分最丰富为20种,亲本材料枳和华盛顿脐橙果皮中的黄酮类成分分别是8和9种。通过和亲本枳和华盛顿脐橙对比,卡里佐脐橙果皮提取物中黄酮类生物活性物质种类以及等主要成分的含量表现出杂种优势。此外,卡里佐枳橙提取物中的黄酮成分基本囊括了亲本的所有黄酮成分。各柑橘果皮中的黄酮类成分种数均高于果肉中的种数。四种枳橙果实提取物的类黄酮成分组成差异不大,无明显变异,其特征峰主要为新北美圣草苷(neoeriocitrin)、柚皮苷(naringin)、新橙皮苷(neohesperidin)和枸橘苷(ponrincin)。2.枳橙果实抗氧化活性分析2.1 HPLC-ABTS+分析枳橙果实各黄酮成分的抗氧化活性实验系统条件如下:HPLC分析系统:流动相:A为甲醇,B为0.1%甲酸溶液;梯度洗脱￥程序条件:0—20 min 37%—50%A;20—35 min 50%—80%A;35—40min 80%—100%A;40—50 min 100%A;50—60 min 37%A,;流速:0.7 m L min-1;柱温:25°C;进样体积30μL;PAD检测波长为283nm类黄酮成分。(2)柱后分析系统:ABTS+自由基溶液泵入流速为0.40 m L min-1,检测波长设定为414 nm;柱后自由基衍生反应系统温度为40°C。结果表明,在枳橙果皮提取物中贡献主要抗氧化能力的黄酮成分为新北美圣草苷,新橙皮苷和枸橘苷也具有较弱的抗氧化能力贡献;而在枳橙果肉以及枳和华盛顿脐橙果实提取中,则没有黄酮成分明显地显示出在线清除ABTS+能力。2.2 HPLC-FRSD测定枳橙果实提取物总抗氧化活性实验系统条件如下:HPLC分析系统:流动相:A为甲醇,B为0.1%甲酸溶液;等度洗脱程序条件:37%A,63%B;流速:0.91 m L min-1;保护柱柱温:30°C;进样体积30μL;PAD检测波长为283nm类黄酮成分。(2)柱后分析系统:ABTS+自由基溶液引入流速均为0.60 m L min-1。ABTS+自由基溶液检测波长为414 nm;柱后自由基衍生反应系统温度为40°C。每个样品抗氧化活性分析时间为4 min。结果显示6种柑橘果皮果肉的抗氧化活性顺序(VE当量)为:墨西哥果皮(85.00±0.24)>安陆果皮(84.27±1.18)>卡里佐果皮(83.45±0.97)>Rusk果皮(80.45±0.63)>枳果皮(77.59±0.72)>华盛顿脐橙果皮(74.60±0.45)>华盛顿脐橙果肉(73.10±0.07)>墨西哥果肉(71.73±1.47)>卡里佐果肉(70.23±0.06)>安陆果肉(69.94±0.15)>Rusk果肉(65.53±1.06)>枳果肉(58.87±0.45)。2.3离线测定枳橙果实提取物总抗氧化活性通过DPPH法,ABTS法和FRAP法三种离线法测定6种柑皮和果肉甲醇提取物的抗氧化活性,并结合在线ABTS法检测的结果,利用抗氧化活性综合指数￥评价其抗氧化活性。结果显示6种柑橘果皮果肉的抗氧化活性顺序(APC综合评价指数)从高到低依次为:墨西哥果皮(97.03%)>安陆果皮(94.95%)>卡里佐果皮(86.67%)>腊斯克果皮(84.38%)>枳果皮(76.75%)>华盛顿脐橙果皮(73.20%)>华盛顿脐橙果肉(56.46%)>卡里佐果肉(55.07%)>墨西哥果肉(54.13%)>Rusk果肉(52.22%)>安陆果肉(47.28%)>枳果肉(40.15%)。2.4枳橙果实总抗氧化活性与总酚总黄酮含量相关性本文通过福林酚法和氯化铝法分别测定了枳橙果实的总酚含量和总黄酮含量,并分析各种方法测定抗氧化活性与总酚含量总黄酮含量与的关系。(1)枳橙果实总酚含量测定。果皮提取物中总酚含量最高的为墨西哥枳橙。果肉提取物中总酚含量最高的为华盛顿脐橙和墨西哥枳橙。(2)枳橙果实总黄酮含量测定。果皮提取物中总黄酮含量最高的为墨西哥枳橙和卡里佐枳橙;果肉提取物中总黄酮含量较高的为华盛顿脐橙。(3)相关性分析显示柑橘果实的抗氧化活性与酚类物质和黄酮类物质总含量,呈现显著性正相关(p<0.05)。表明酚类物质和黄酮类物质是潜在柑橘抗氧化活性贡献者。3.枳橙果实提取物抗肥胖活性分析雌性C57BL/6小鼠被分别饲喂对照低脂饲料,高脂饲料(HF),高脂饲料添加1%w/w卡里佐枳橙果皮提取物(CPE)或1%w/w卡里佐枳橙果肉提取物(CFSE)共计8周。结果发现,CPE和CFSE都具有减轻高脂膳食诱导的营养性肥胖能力。在CPE和CFSE处理组中,CPE和CFSE能够抑制高脂膳食造成的小鼠体重增长,空腹血糖水平提高(p<0.05),此外CPE能够降低血清中总胆固醇水平(p=0.004),低密度脂蛋白胆固醇水平(p=0.042)。肝脏切片结果显示CPE和CFSE能抑制小鼠肝脏中脂质的积累,并且和HF组比较,HF+CFSE组小鼠肝脏总胆固醇水平下降(p=0.002)。通过实时荧光定量PCR对小鼠肝脏中基因表达水平检测,我们发现,CPE和CFSE可以降低PPARγ的表达水平(p<0.05),显著抑制(adipocyte fatty-acid-binding protein,ap2)和凋亡相关因子(factor associated suicide,FAS)等PPARγ靶基因的表达水平(p<0.05)。此外,CPE还能抑制LXRβ及其靶基因脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)的表达水平(p<0.05),CFSE可抑制载脂蛋白E(apolipoprotein E,Apo E)的m RNA的表达(p=0.032)。综合以上实验结果,我们可以得出以下实验结论:枳橙果实中主要的黄酮成分为黄酮-O-糖苷类化合物;枳橙及枳橙亲本果皮提取物中的化学成分多于果肉中的;枳橙果实提取物中的黄酮成分分布和抗氧化能力无显著差异;卡里佐枳橙的抗氧化能力较可能亲本枳和华盛顿脐橙显示出了杂种优势;枳橙果实提取物能够预防由高脂膳食诱导的小鼠的营养性肥胖;枳橙果实提取物可能通过PPARγ和LXRβ等核受体信号通路起到调节作用。