论文部分内容阅读
捻转血矛线虫病是对反刍动物危害极大的寄生性疾病,该病已波及到世界各地,严重阻碍了畜牧养殖业的可持续性发展。对于该病的防治,目前仍是依靠传统的化学药物驱虫方法,而随着寄生虫对化学驱虫药物耐药性的不断提高及消费者对无化学有机农产品需求的不断增加,越来越多的学者开始探究该病的其它防控方法。另一方面,寄生虫疫苗没有获得生产许可,因此利用生物方法控制捻转血矛线虫病将成为一个永恒的发展方向。
捻转血矛线虫病流行的一个很重要的特点是春季高潮,在“春潮(Springrise)”发生时伴有宿主营养不良,常造成大批羊只死亡,而滞育现象则被认为是出现春季发病高潮的主要原因;因为在干燥寒冷的冬季,牧地上几乎所有的感染性幼虫和虫卵均不能正常越冬,在宿主体内进入滞育期可能是唯一的越冬方式。因而控制线虫的滞育、探明产生该现象的生物化学和分子生物学机制很可能是解决该病的周期性流行和季节性爆发的关键问题。
对于寄生性线虫的滞育现象,国外的研究大多都停留在一些假设和推理上,直接参与相关信号转导机制和效应机制的分子还未被证实。国内还未见相关调控寄生性线虫生长发育机制的报道。
本研究以培养获得的捻转血矛线虫滞育期虫体及同期正常发育的虫体为研究材料,采用设计的锚定引物和随机引物,通过mRNA差异显示PCR技术对滞育期幼虫的差异表达基因进行了筛选。结果,生物信息学分析表明:其中的几个未知差异序列与秀丽线虫已知基因rps-30(Ribosomal Protein,Small subunit),T24F1.2(一种保守假定蛋白)的mRNA具有同源性,rps-30,T24F1.2等已被证明参与了秀丽隐杆线虫的滞育形成,但这两个基因的深入研究还较少。
本研究参照已发表的秀丽隐杆线虫T24F1.2及rps-30的启动子序列,根据5’侧翼区设计引物,本实验分别将2060 bp及2065bp的序列克隆到线虫专用表达载体pPD95.77 GFP基因的上游,构建了T24F1.2-pPD95.77及rps-30-pPD95.77线虫荧光表达载体,利用显微注射技术将构建的真核表达载体注射到C.elegans的性腺,通过检测注射后线虫的表型变化和荧光蛋白(GFP)表达情况分析启动子的活性,从蛋白表达水平研究了T24F1.2及rps-30基因的功能。试验结果显示T24F1.2基因的5’侧翼区启动功能较强,可启动GFP在C。elegans体内呈规律性表达,且稳定性较好;GFP可在C.elegans整个生命周期中都有表达,表达部位主要集中在线虫的肠道,但各个虫体的表达强弱有所差异,成虫整个肠道都强烈表达,而L1-L4期幼虫在肠道前端及末端表达荧光信号较强,而肠道中段荧光信号相对较弱。结果显示rps-30基因的5’侧翼区启动功能较强,有转录所需的各种顺式作用元件,可启动GFP在C.elegans体内特异性表达;GFP在C.elegans除胚胎外的整个生命周期中都有表达,表达部位主要集中在头部神经、食道、咽部、尾部神经及肠道细胞,并呈现明显的区段性,但虫体间的表达部位有个体差异。
综上所述,荧光表达的成功证明了T24F1.2及rps-30有较好的启动活性,通过荧光表达特性的分析,不仅很好地研究了T24F1.2、rps-30在秀丽线虫自身体内的功能,也为捻转血矛线虫中与之同源的的滞育差异显示基因的研究提供了重要的参考,进而为防治捻转血矛线虫病提供了一种新的方法。