目的对马钱子中生物碱进行系统的提取分离纯化,建立马钱子总生物碱高效液相色谱(HPLC)特征图谱分析方法,为马钱子的质量控制奠定一定的物质基础。观察马钱子中生物碱单体成分对人结肠癌HT-29细胞增殖的影响,筛选主要活性成分,并进一步研究其对人结肠癌HT-29细胞的作用机制。方法通过加热回流的方法对砂烫马钱子进行提取,采用硅胶柱色谱,薄层色谱,半制备高效液相色谱等方法进行分离纯化,得到生物碱单体化合物。将十批砂烫马钱子采用加热回流的方法进行提取,得到马钱子总生物碱,利用HPLC法建立马钱子总生物碱特征图谱。运用MTT法,筛选出对人结肠癌HT-29细胞抑制作用较强的生物碱单体成分,并计算其IC50值。取主要活性成分,比较在不同浓度作用下分别培养24 h、48 h、72 h后对人结肠癌HT-29细胞的抑制作用;运用流式细胞仪检测不同实验组对HT-29细胞凋亡、细胞周期以及线粒体膜电位的影响;利用Western Blot法检测不同实验组P53、caspase3、parp、caspase9、bcl-2蛋白表达情况。结果1.通过对砂烫马钱子系统的提取分离纯化,得到10种生物碱化合物,利用波谱分析技术最终鉴定出9种生物碱单体成分,包括马钱子碱、士的宁、伪士的宁、伪马钱子碱、异士的宁、异马钱子碱、奴弗新、伊卡金、和16-甲氧基原士的宁。2.采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”对10批马钱子总生物碱进行相似度评价,建立了马钱子总生物碱的HPLC特征图谱,10批样品相似度均≥0.90,确定了 10个共有峰,并根据对照品确认,其相对保留时间为0.81(峰1,异士的宁),0.90(2号峰,士的宁),0.96(3号峰,马钱子碱),1.00(4号峰,16-甲氧基原士的宁),1.21(6号峰,奴弗新),1.32(8号峰,伊卡金)。3.利用MTT法发现,马钱子碱、伪士的宁、伪马钱子碱与异马钱子碱对人结肠癌HT-29细胞有明显的抑制作用,与阳性对照组相比,差异无统计学意义。其 IC50 值,分别为 0.192±0.18、0.207±0.13、0.265±0.43、0.228±0.22(μmol·mL-1)。4.马钱子碱与伪士的宁对人结肠癌HT-29细胞有一定的抑制作用且其作用呈现时间依赖和剂量依赖关系。与空白组相比,不同浓度马钱子碱和伪士的宁作用48 h后HT-29细胞早期凋亡率、晚期凋亡率和总凋亡率均有显著差异(**P<0.01),各组线粒体膜电位明显降低(**P<0.01);与空白组相比,马钱子碱(250μmol·L-1)处理后HT-29细胞在Gi期细胞数量明显增加,S期和G2期细胞数量明显减少,差异有统计学意义(**P<0.01),伪士的宁(250μmol·L-1)处理后HT-29细胞Gi期细胞数量明显增加,S期细胞数量基本不变,G2期细胞数量明显减少,差异有统计学意义(*P<0.05)。与空白组比较,125 μmol·L-1马钱子碱作用下p53、parp蛋白表达升高(*P<0.05),250μmol·L-1和500 μmol·L-1的马钱子碱与伪士的宁作用下p53、caspase3、parp、caspase9蛋白表达均显著升高(**P<0.01),各组bcl-2蛋白表达明显下降(**P<0.01),各组差异具有统计学意义。结论本实验从马钱子中分离得到生物碱类化合物10种,利用波谱技术鉴定得到9种生物碱单体成分,所建马钱子总生物碱HPLC特征图谱,方法简便、快速、准确性高、重现性好,可为进一步研究马钱子生物碱类化学成分及质量控制提供科学依据。所得生物碱单体成分对人结肠癌HT-29细胞有一定的抑制作用,其中马钱子碱作用最强,伪士的宁次之。马钱子碱与伪士的宁对人结肠癌HT-29细胞具有显著的抑制作用,且呈时间-剂量依赖性;还可影响线粒体膜电位的变化,使线粒体膜电位降低,诱使HT-29细胞在G1期发生阻滞,可通过上调p53、caspase3、parp、caspase9蛋白表达水平,下调bcl-2蛋白表达水平来诱导细胞凋亡。