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传染性法氏囊病毒（infectious bursal disease virus,IBDV）是一种无囊膜双链RNA病毒,它所引起的鸡传染性法氏囊病（infectious bursal disease。IBD）是鸡的一种急性高度接触性致死性传染病,是造成养鸡业严重的经济损失的重要疫病之一。病毒受体在病毒吸附、侵入过程中起着极其重要的作用,病毒吸附是启动感染的第一步。研究IBDV的病毒受体,对于探明IBD发生的分子机制,阻断病毒对细胞的吸附和侵染过程,防止传染病的发生有重大意义。鸡胚成纤维细胞（chickenembryo fibroblast,CEF）也是IBDV的易感细胞,通常被用于IBDV的增殖。构建易感细胞的cDNA文库并利用阻断病毒感染的单克隆抗体筛选受体基因是病毒受体研究中最常用的方法。为了研究存在于CEF表面的IBDV受体或感染相关的分子,本研究首先构建了高质量的CEF细胞cDNA T7噬菌体表达文库和真核表达文库,并建立了制备高效电转化感受态细胞E.coli DH10B方法,用于真核表达文库的扩增;然后将生物素-链亲和素（biotin- streptavidin）用于免疫组化,建立了用于筛选阻断病毒感染的单克隆抗体的方法,并制备了阻断IBDV感染CEF的儿株单克隆抗体,为克隆存在于CEF的IBDV受体等感染相关的分子的基因,及揭示IBDV感染CEF的机理奠定了基础。1鸡胚成纤维细胞cDNA T7噬菌体表达文库的构建及鉴定培养CEF细胞,利用oligo（dT）-纤维素亲和层析法制备CEF细胞的mRNA,逆转录合成的cDNA双链,与T7 EcoRⅠ/HindⅢ载体臂定向连接,噬菌体包装,构建cDNA表达文库。测定文库的滴度和并用PCR进行重组子鉴定。将文库扩增并鉴定插入片段的长度及分布。结果显示,文库初始滴度为2.2×107 pfu/mL,扩增后文库的滴度为3.5×1010pfu/mL。插入片段的平均长度1.3kb,主要分布在0.4～3kb之间。说明成功构建的CEF细胞cDNA T7噬菌体表达文库,为进一步研究CEF细胞以及传染性法氏囊病毒（IBDV）受体研究奠定了基础。2鸡胚成纤维细胞cDNA真核表达文库的构建从CEF提取mRNA,反转录合成双链cDNA,与EcoRⅠ接头连接,经NotⅠ酶切后用spin column除去小于500 bp的片段,连接到预先经EcoRⅠ和NotⅠ双酶切的真核表达质粒pAP3neo载体上,将重组质粒电转化DH10B,测定文库的容量大小并通过colony PCR鉴定插入cDNA片段的大小。经测定,原始文库滴度为2.7×106CFU/mL,重组率大于95%,重组子中插入片段的长度大部分在0.5～2.0kb之间,平均插入外源片段长度大于1.0 kb的约占85.7%。表明构建的文库能够充分满足克隆低丰度mRNA的要求,可以用于筛选IBDV在CEF表面的受体或感染相关分子。3高效电转化感受态细胞的制备为了能够制备高效的电转化感受态细胞,以用于cDNA真核表达文库的转化和扩增。通过对影响转化效率的参数:生长状况、洗液种类、最后细胞密度、电击强度等各个条件进行优化,建立了简单实用的高效电转化感受态细胞E.coli strain DH10B的制备方法,制备的感受态细胞的转化效率达2～6×109cfu/μgDNA,满足了文库转化、基因表达和克隆的特殊需要。同时也为其它大肠杆菌电转化感受态的制备提供了优化思路和借鉴。4阻断IBDV感染CEF的单克隆抗体筛选方法的建立为了制备阻断IBDV感染CEF的单克隆抗体,必须先建立一种有效的筛选单抗的方法。本研究基于免疫细胞化学的方法,采用Biotin-Streptavidin建立了感染阳性细胞数减少实验的方法,可用于阻断IBDV感染CEF的单克隆抗体的筛选。实验表明该方法简单、敏感、实用,是用来筛选阻断IBDV感染的mAb的较好的方法。该方法的建立制备阻断IBDV感染CEF的单克隆抗体奠定了基础,同时该系统的建立也为其它病毒受体的研究从方法学上提供借鉴。5阻断IBDV感染CEF的单克隆抗体的制备和鉴定制备阻断IBDV感染CEF的单克隆抗体,用来筛选或鉴定与单抗作用的受体蛋白或基因,是研究病毒受体的重要方法。CEF是IBDV易感细胞之一,该细胞表面有介导其感染的受体。采取不同方案免疫BALB/c小鼠,经三次免疫后采血测定抗体总效价和阻断感染的效果可见,采用长单层的CEF不加佐剂处理直接腹腔注射免疫的可获得高水平的阻断病毒感染的特异性抗体的产生。用病毒感染细胞数减少实验筛选到3株mAb能阻断IBDV感染CEF,其中一株阻断率达到84.5%。且阻断效率在一定范围内具有剂量依赖性。通过流式细胞仪进行结合实验标明该mAb所针对的表位存在丁CEF细胞表面,但是表达量非常低。推测该蛋白很可能是IBDV的受体之一或重要的感染相关分子,因为不能彻底的阻断感染可见另有其它受体或感染相关分子的存在,这与已报道的文献相符合。该单克隆抗体的制备这为揭示IBDV感染CEF的机理奠定了基础。