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肾细胞癌(RCC,Renal Cell Carcinoma)是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤,其发病率逐年上升,是全球第七大恶性肿瘤疾病。长链非编码RNA(lncRNA,long non-codingRNA)在调节癌症基因的异常表达过程中扮演重要角色,与肿瘤发生发展密切相关。根据lncRNA的功能模式,可分为调节临近基因或者自身母基因的顺式调节模式(cis transcriptional regulation)和调节远端基因的反式调节模式(trans transcriptional regulation)。在肾癌组织细胞中,编码多药及毒素外排转运体MATE 2-K的SLC47A2基因的表达水平受到显著抑制,对肾癌细胞中抗癌药物的代谢和相关内源性物质的外排产生重要影响。UCSCGenome Browser数据库注释了SLC47A 基因座存在四个潜在启动子和三个转录因子富集区,预示SLC47A2基因非mRNA转录本(SLC47A2 associated non-mRNATranscript,SANT)的存在。基于从 lncRNA 的顺式调节模式,推测SLC47A2基因可能通过表达SANT参与自身编码基因的调节,并与肾癌中编码蛋白的特异低表达密切相关。通过qPCR检测了调节区下游非mRNA外显子区域的转录本表达水平,发现在正常组织细胞的调节区Section3下游存在高表达转录本,而在肾癌组织中受到显著抑制,推测该区域即为SANT的特异序列,并命名该转录本为SANT1。以癌旁组织RNA样品为模板,通过5’/3’RACE获得了SANT1序列全长并构建了表达质粒。在786-O、ACHN、769-P和Caki-1细胞中进行SANT1的高表达和siRNAknockdown之后,发现SLC47A2的mRNA和蛋白水平均有显著变化,证明了 SANT1对编码基因的顺式调节模式。SANT1 knockdown引起的SLC47A2表达抑制增强了 769-P细胞中代谢酶FH、SDH B和SDH D抑制后对葡萄糖转运体GLUT1的诱导水平,说明肾癌细胞中SANT1的低表达参与了肾癌细胞的能量代谢网络重构。通过相关miRNA靶向实验并结合软件分析,发现miR-17家族成员与SANT1和mRNA3’UTR均有结合关系。但报告基因结果显示,miR-17家族成员代表miR-20a和miR-93与SANT1和mRNA3’ UTR均无直接结合作用,排除了 SANT1的ceRNA调节机制。但是,在四个肾癌细胞系中高表达或抑制miR-20a后,却发现它与SLC47A2的表达调节密切相关,而且表现出一种双向调节模式:不同细胞系在相同的处理条件下,mRNA的转录可以表现为正向诱导或反向抑制,说明miR-20a对SLC47A2的表达调节并不是通过直接结合而发挥抑制效应。我们推测受miR-20a调节的下游基因既有参与SLC47A2激活作用的转录因子,也有参与基因表达抑制的转录因子,当miR-20a表达改变后,两种类型的转录因子达到新的平衡,决定SLC47A2最终的表达水平。通过UCSC Genome Browser数据库的基因注释信息和查阅文献,我们发现由c-Myc/MLL1 介导的 H3K4me3、E2F1/HDACs 介导的 H3K27ac 和 EZH2 介导的H3K27me3修饰可能是SLC47A2表达调节过程中最重要的表观修饰信号。有趣的是,c-Myc、E2F1和miR-20a三者可以形成一个调节环路:在这一环路中,c-Myc是激活基因表达的转录因子,而E2F1则是引起基因表达抑制的转录因子,很好地阐释了 miR-20a的双向调节机制。在Co-IP实验中检测到了 769-P细胞系中c-Myc/MLL1和E2F1/HDAC1两种功能型复合物的存在,并通过高表达和抑制实验同样发现了 c-Myc在肾癌细胞系中的双向调节现象。以对c-Myc最为敏感的769-P细胞系为模型,研究了 c-Myc高表达和抑制剂处理后相关蛋白和调节信号的改变。从结果得知,c-Myc基因高表达引起c-Myc和E2F1蛋白水平的上升,对应地启动子区c-Myc/MLL1和E2F1/HDAC1结合率的提高,伴随着H3K4me3修饰水平的提高以及H3K27ac修饰的抑制,S-5-PRNAP II的结合显著降低,最终表现为SLC47A2基因表达抑制。而c-Myc抑制剂10058-F4处理后,胞内c-Myc和E2F1的蛋白水平受到显著抑制,在启动子区c-Myc/MLL1和E2F1/HDAC1的结合均显著降低,引起H3K4me3修饰水平的降低以及H3K27ac修饰的显著上升,S-5-PRNAPII的结合明显上升,基因表达活化。在肾癌组织中,c-Myc和E2F1的蛋白水平均显著提高,启动子区E2F1/HDAC1的结合上调,但c-Myc/MLL1的结合水平却是抑制状态,最终表现为肾癌组织中H3K4me3和H3K27ac的修饰水平均显著抑制。通过ChIP实验,我们发现肾癌中HIF-1α因子的异常表达影响了启动子区c-Myc的靶向结合。至此,我们明确了c-Myc/E2F1/miR-20a环路通过调节启动子H3K4me3和H3K27ac的修饰水平发挥了对SLC47A2表达的双向调节机制。在SANT1高表达的769-P细胞中,mRNA启动子区的S-5-PRNAPII结合水平显著上升,预示了 SANT1同基因转录起始调节的相关性。非编码RNA可能通过翻译潜在的小肽蛋白或作为结合骨架形成RNA-蛋白复合物参与基因转录起始调节。我们构建了 SANT1突变体SANT1-S1和SANT1-S2,它们基本序列完全一致,具有相同蛋白翻译潜能,但只有SANT1-S1与SANT1高级结构类似。在肾癌细胞系中转染表达质粒之后,只有SANT1和SANT1-S1保持了诱导基因表达的功能,说明SANT1的功能基础是其作为蛋白结合骨架的高级结构。通过软件预测,我们发现SANT1和SANT1-S1同SFPQ蛋白具有高结合能力,而SANT1-S2的结合力则被显著削弱。通过CLIP实验,证明了 SANT1与SFPQ的直接结合,同时在SANT1高表达的癌旁组织和769-P细胞中,启动子区SFPQ的结合显著降低,说明SFPQ在SLC47A2启动子区参与形成转录抑制型蛋白复合物。据文献报道,SFPQ可以与HDAC1形成蛋白复合物,通过抑制启动子区H3K27ac的修饰水平而抑制基因表达。由于HDAC1与E2F1形成的复合物同c-Myc/E2F1/miR-20a环路对SLC47A2的表达调节密切相关,因此推测SFPQ与E2F1/HDAC1可以形成复合物,共同参与基因表达调节。Co-IP实验验证了 769-P细胞系中SFPQ/E2F1/HDAC1的存在,结构完整的SANT1可以与靶向于SLC47A2的SFPQ/E2F1/HDAC1复合物形成RNA-蛋白复合体,介导E2F1/HDAC1的脱靶。SANT1高表达引起的E2F1/HDAC1的脱靶引起启动子区H3K27ac修饰水平和S-5-PRNAPII结合的显著上调,激活了基因的转录水平。综上所述,c-Myc/E2F1/miR-20a 环路通过 c-Myc/MLL1 和 E2F1/HDAC1 复合物参与调节SLC47A2启动子区H3K4me3和H3K27ac的修饰水平而发挥双向调节机制。在肾癌组织中,HIF因子的异常表达可能影响了启动子区c-Myc的靶向结合,而引起H3K4me3修饰信号的抑制;E2F1表达量显著升高,启动子区E2F1/HDAC1的结合上调,显著抑制了 H3K27ac修饰水平,最终导致SLC47A2基因表达抑制。在癌旁组织中,E2F1的表达水平更低,同时SANT1的高表达引起E2F1/HDAC1的脱靶,最终导致H3K27ac信号的上调,显著提高了,SLC47A 基因表达水平。